Estandarización de la integración del gen pncA en Mycobacterium tuberculosis pncA-knockout mediante una técnica de complementación de genes

Abstract

La tuberculosis (TB) es una enfermedad infecciosa contagiosa causada por la bacteria Mycobacterium tuberculosis (MTB), que afecta principalmente a los pulmones. Una de las drogas para tratar la TB es la pirazinamida (PZA), cuyo mecanismo de acción se inicia con la conversión de la PZA a su forma activa, ácido pirazinoico (POA) por acción de la pirazinamidasa (PZAsa) codificada por el gen pncA. La gran mayoría de pacientes resistentes a esta droga presentan mutaciones en pncA. Sin embargo, se han reportado resultados discordantes entre la actividad enzimática de PZAsa y la susceptibilidad a la droga usando aislados clínicos que presentan mutaciones en otras regiones genómicas.Por ello, el propósito de este estudio es estandarizar la integración de forma estable del gen pncA de tipo salvaje en el genoma de M. tuberculosis H37Rv con deleción de pncA (MTB-KO), para restaurar la actividad de la PZAsa, la susceptibilidad a la PZA y estandarizar un modelo genético que permita evaluar el impacto de mutaciones específicas del gen pncA en la resistencia a PZA. Finalmente, se logró integrar exitosamente el plásmido integrativo con el gen pncA en el genoma de MTB-KO y se demostró que la cepa complementada recuperó la expresión del gen pncA, la producción de POA y la susceptibilidad a PZA. En cambio, la cepa MTB-KO o con el plásmido vacío no produjo POA ni fue sensible a la droga. Este modelo permitió restaurar la susceptibilidad a PZA usando el gen de pncA nativo, en un contexto genético controlado y sin interferencia de otras mutaciones.

Tuberculosis (TB) is a contagious infectious disease caused by the bacterium Mycobacterium tuberculosis (MTB), which mainly affects the lungs.One of the drugs used to treat TB is pyrazinamide (PZA), whose mechanism of action begins with the conversion of PZA to its active form, pyrazinoic acid (POA), by pyrazinamidase (PZAsa), encoded by the pncA gene. Most patients resistant to this drug have mutations in pncA. However, conflicting results have been reported regarding PZA enzyme activity and drug susceptibility in clinical isolates harbouring mutations in other genomic regions.Therefore, the purpose of this study is to standardise the stable integration of the wild-type pncA gene into the genome of M. tuberculosis H37Rv with pncA deletion (MTB-KO) genome, to restore PZAsa activity and susceptibility to PZA, and to standardise a genetic model that allows the evaluation of the impact of specific mutations in the pncA gene on PZA resistance. Finally, the integrative plasmid carrying pncA was successfully integrated into the MTB-KO genome, and the complemented strain recovered pncA gene expression, POA production, and PZA susceptibility. In contrast, the MTB-KO strain or the strain with the empty plasmid did not produce POA and was not sensitive to the drug. This model allowed susceptibility to PZA to be restored using the native pncA gene in a controlled genetic context, without interference from other mutations.