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Evaluación de marcadores genéticos para la genotipificación de Leptospira spp. patógena en muestras de reservorios de Belén-Iquitos

Resumen

La leptospirosis es una de las zoonosis más distribuidas a nivel mundial, y en el Perú ha cobrado mucha importancia en la salud pública debido al aumento en la prevalencia de la enfermedad en la región amazónica, sin embargo, su diagnóstico es complicado ya que sus manifestaciones clínicas son inespecíficas y muy variables. Por esta razón se necesita de la implementación de nuevas técnicas de diagnóstico que sean rápidas y efectivas, que sirvan para la construcción de la epidemiología de la enfermedad y faciliten el seguimiento del riesgo en animales reservorios, identificando qué serovariedades albergan de modo que se puedan crear vacunas eficientes que eviten brotes futuros de Leptospirosis. El presente estudio tuvo como objetivo desarrollar una sistema basado en melting de alta resolución (HMR, por sus siglas en inglés) para la identificación de subespecies patógenas de Leptospira presentes en muestras de orina de perros y cerdos provenientes del sector 20 en el distrito de Belen-Iquitos, para ello, se colectaron 63 muestras orina de perros domésticos y 88 muestras de orina de cerdos provenientes camales clandestinos. Luego se seleccionaron los genes marcadores lipL32, lpxC, secY, ompL1 y wzy para el análisis de melting, debido a sus propiedades antigénicas, sin embargo sólo los tres primeros se utilizaron para la genotipificación de Leptospira por el alto poder discriminatorio (DI=0.94) que se conseguía al utilizarlos en simultáneo en 19 cepas de referencia de Leptospira patogéna, además los tres presentaron un valor de sensibilidad de 10^1 bacteria/μL y eficiencia de tipificación mayor al 85%. La reproducibilidad del HRM fue de 100% y el porcentaje de confidencia de los clusters generados fue mayor al 90%. El sistema de genotipificación en las muestras inició con la detección de aquellas que albergaban Leptospira patógena, utilizando el gen lipL32 en un PCR cuantitativo, donde se obtuvo 14 muestras positivas en perros y 13 en cerdos. Luego se determinó el genotipo en las muestras por comparación con los genotipos que se deteerminaron en las cepas de referencia, obteniéndose que 11 de las muestras de perros correspondían a al genotipo 2, dentro del cual se encuentran las serovariedades: L. interrogans Australis Australis Ballico, L. interrogans Autumnalis Autumnalis Akiyami, L. Interrogans Djasiman Djasiman Djasiman y L. interrogans Icterohaemorragiae Copenhageni M20 y una pertenecía a la serovariedad L. kirschneri Grippatyphosa Gripatyphosa Moskava V. En cerdos también se identificaron muestras pertenecientes al genotipo 2, sin embargo, cuatro pertenecían a la especie L. santarosai, y dos a las especies L. kirschneri y L. noguchii. Finalmente los genotipos fueron determinados por el sistema fueron verificados mediante secuenciamiento y se encontró que todos perfiles de melting obtenidos correspondían a un genotipo específico. En conclusión se reporta por primera vez un sistema de genotipificación de subespecies patógenas de Leptospira spp. realizado directamente de muestras de orina de perros y cerdos (potenciales reservorios) con un alto poder discriminatorio, además se reportan tres especies (L. santarosai, L. kirschneri y L. noguchii) que no han sido identificadas en cerdos hasta la fecha.