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Termoestabilización de una proteína azul fluorescente

Resumen

Las proteínas fluorescentes son ampliamente utilizadas en biología molecular y diagnóstico. Sin embargo, su uso en otras industrias, como la manufactura, donde se requieren condiciones más exigentes, ha sido poco explorado. Un ejemplo es la inspección de fisuras con líquidos penetrantes fluorescentes, que necesitan resistir solventes y, frecuentemente, altas temperaturas. Además, sus propiedades espectrales deben ser compatibles con las lámparas y gafas de inspección. La proteína shBFP-N158S/L173I, derivada de la cromoproteína de Stichodactyla haddoni, es una buena candidata por su alto brillo y pico de excitación a 375 nm. Sin embargo, proteínas relacionadas han mostrado ser sensibles a temperaturas elevadas y pH extremos, lo que podría limitar su uso. Este trabajo presenta resultados preliminares del diseño computacional de una variante multipunto potencialmente termoestable derivada de shBFP-N158S/L173I. Se reconstruyó la estructura de la proteína inmadura (premutbase) combinando datos cristalográficos y predicciones de AlphaFold. Se identificaron mutaciones estabilizadoras mediante Consensus Finder, las cuales fueron filtradas y posteriormente seleccionadas tras calcular el ΔΔG con FoldX. La estabilidad estructural se evaluó con simulaciones de dinámica molecular de 100 ns a distintas temperaturas. Fold X identificó como mutaciones puntuales más favorables a H72Y, T36E, D14R, T194V y C155K, que se combinaron para generar una variante multipunto. El análisis de la desviación cuadrática media (RMSD) reveló que la premutbase presentó valores promedio entre 0.16 y 0.21 nm en el rango de 300 y 350 K, mientras que la variante multipunto mostró valores menores, entre 0.11 y 0.13 nm, evaluados hasta 320 K. Los datos a temperaturas más altas están en análisis. La variante también exhibió una reducción en las fluctuaciones de RMSD, lo que sugiere una menor flexibilidad estructural. El diseño computacional permitió identificar mutaciones que podrían mejorar la termoestabilidad de la proteína original. La variante multipunto resultante mostró propiedades estructurales más estables en simulaciones.