Estandarización de la técnica de Amplificación Isotérmica Mediada por Bucles (LAMP) dúplex para la detección simultánea de Aeromonas salmonicida y Yersinia ruckeri en cepas aisladas de Oncorynchus mykiss “Trucha arcoíris”

Abstract

Aeromonas salmonicida y Yersinia ruckeri son bacterias patógenas de Trucha arcoíris; su detección temprana mediante el uso de pruebas de diagnóstico es fundamental para evitar la propagación bacteriana y la mortalidad excesiva en los sistemas de producción. Sin embargo, el uso de pruebas de diagnóstico no se realiza debido a que son costosas, requieren de laboratorios sofisticados y se realizan en ciudades alejadas de los centros de producción. Por ello, este trabajo tuvo como objetivo estandarizar la técnica de Amplificación Isotérmica Mediada por Bucle (LAMP), una prueba de diagnóstico molecular rápido altamente sensible y de bajo costo, para detectar simultáneamente A. salmonicida y Y. ruckeri en cepas aisladas de Trucha arcoíris. Se diseñó primers LAMP para la detección de A. salmonicida y Y. ruckeri mediante los genes vapA y rucC-rupB, respectivamente. Se elaboró un protocolo LAMP DÚPLEX corrido a 60°C durante 60 min y detenido a 80°C por 10 min. Los primers fueron específicos para A. salmonicida y Y. ruckeri, no observándose reacciones cruzadas con Aeromonas hydrophila, Virus de la Necrosis Pancreática Infecciosa, Flavobacterium psychrophilum, Renibacterium salmoninarum, especies relacionadas con enfermedades infecciosas de Trucha arcoíris. Además, de Staphylococcus aureus, Echerenchia coli, Pseudomonas aeruginosa y Yersinia enterocolítica, especies bacterianas relacionadas con la contaminación ambiental y de manipulación. Finalmente, la sensibilidad analítica de LAMP fue superior a la técnica gold estándar PCR.

Aeromonas salmonicida and Yersinia ruckeri are pathogenic bacteria of rainbow trout; Its early detection through the use of diagnostic tests is essential to avoid bacterial spread and excessive mortality in production systems. However, the use of diagnostic tests are not implements because they are expensive, require sophisticated laboratories and are carried out in cities far from production centers. Therefore, this work aimed to standardize the Loop Mediated Isothermal Amplification (LAMP) technique, a highly sensitive and inexpensive rapid molecular diagnostic test, to simultaneously detect A. salmonicida and Y. ruckeri in isolated strains of rainbow trout. LAMP primers were designed for the detection of A. salmonicida and Y. ruckeri through the vapA and rucC-rupB genes, respectively. A LAMP DUPLEX protocol was developed, running at 60°C for 60 min and stopped at 80°C for 10 min. The primers were specific for A. salmonicida and Y. ruckeri, not observing cross-reactions with Aeromonas hydrophila, Infectious Pancreatic Necrosis Virus, Flavobacterium psychrophilum, Renibacterium salmoninarum, species related to infectious diseases of rainbow trout. In addition, Staphylococcus aureus, Echerenchia coli, Pseudomonas aeruginosa and Yersinia enterocolitica, bacterial species related to environmental contamination and handling. Finally, the analytical sensitivity of LAMP was superior to the gold standard PCR technique.