Estudio del efecto de mutaciones en la metalochaperona Rv2059 sobre la capacidad enzimática de la pirazinamidasa de Mycobacterium tuberculosis

Abstract

La pirazinamida (PZA) desempeña un papel esencial en el tratamiento de la tuberculosis. Aunque la resistencia a esta droga se ha vinculado principalmente a mutaciones en el gen pncA, hasta un 30% de casos de resistencia no presentan tales alteraciones genéticas. En este estudio analizó cómo mutaciones en la metalochaperona Rv2059 podrían alterar su capacidad para activar la enzima PZAsa y con ello una posible contribución a la resistencia a la droga PZA. La metalochaperona Rv2059 tiene la capacidad de activar la metaloenzima pirazinamidasa (PZAsa), lo que sugiere un posible papel en el mecanismo de acción y resistencia a la PZA. Investigamos dos mutaciones en Rv2059 con el fin de encontrar algún efecto en su actividad de entrega de metales, una en el sitio de coordinación de metal (Glu341Gly) y otra en un lugar distante a éste (Val166Ile), utilizando ensayos con proteínas recombinantes y en la bacteria M. tuberculosis. Los resultados del primer ensayo ,usando proteínas recombinantes, confirmaron que la proteína recombinante Rv2059 Wt podía reactivar la proteína recombinante PZAsa desprovista de metales (PZAsa-Apo). Sin embargo, las proteínas mutantes Rv2059 Glu341Gly y Rv2059 Val166Ile no mostraron diferencias significativas en el proceso de reactivación en comparación con la proteína Rv2059 nativa (p=0.22 y p=0.23 respectivamente). Por otro lado, la eliminación de la metalochaperona en M. tuberculosis a través de un proceso de remoción pareció afectar la entrega de metales a la enzima PZAsa o perturbar el mecanismo de activación de la prodroga PZA, lo que resultó en resistencia, como se evidenció en los resultados de TEMA (MIC: 200 μg/ml) y en la notable reducción del flujo de POA en comparación con la cepa de referencia H37Rv (p<0.001).En cuanto a las mutantes, parecieron modificar el flujo de POA (H37Rv:Rv2059Glu341Gly (p=0.001), H37Rv:Rv2059 Val166Ile (p=0.002)), pero la concentración inhibitoria mínima (MIC) no experimentó alteraciones en comparación con la cepa de referencia H37Rv (MIC: 50 μg/ml). En resumen, nuestros hallazgos indican que la metalochaperona Rv2059 podría desempeñar un papel importante en el mecanismo de activación de la PZA, y que las mutaciones estudiadas no afectan la actividad de la metalochapeorna Rv2059 y con ello no están relacionadas con la resistencia a PZA. Este estudio contribuye al entendimiento de cómo las metalochaperonas pueden influir en los mecanismos de resistencia a las drogas y mutaciones en la mismas podrían estar viéndose compensadas por el mismo sistema para evitar la pérdida de la función de la proteína.