Publicación: Comprehensive analysis of resistance to rifampicin in Mycobacterium tuberculosis: genomic, functional, and structural insights
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Resumen
Mycobacterium tuberculosis (Mtb) sigue siendo uno de los patógenos más mortales a nivel mundial, a pesar de ser una enfermedad prevenible. La tuberculosis (TB) se trata con una combinación de cuatro medicamentos antituberculosos de primera línea: rifampicina (RIF), isoniacida, pirazinamida y etambutol, para cepas sensibles a los medicamentos. Entre estos, la RIF es uno de los agentes más potentes para controlar la enfermedad. Sin embargo, la resistencia a la RIF conlleva la aparición de casos de TB resistente a la RIF (RR-TB) o multidrogo resistente (MDR-TB). El mecanismo principal de resistencia implica mutaciones en el gen rpoB, que es responsable de aproximadamente el 95% de los casos. No obstante, todavía se están identificando otros mecanismos moleculares y condiciones que podrían contribuir a la propagación de las poblaciones RR-TB y MDR-TB. Esta investigación doctoral se centra inicialmente en un análisis retrospectivo de secuencias genómicas completas de aislados clínicos de pacientes con TB. A través del análisis bioinformático, se detectaron poblaciones heterorresistentes a la RIF y se confirmaron experimentalmente en un estudio piloto mediante la reactivación de los cultivos primarios. Se utilizaron ensayos clave como el método de proporciones en agar, el ensayo de punto final para la determinación de la concentración mínima inhibitoria (CMI) y el ensayo indirecto de susceptibilidad a los medicamentos por observación microscópica para la caracterización de las cepas. Además, por cada cultivo primario, se aislaron colonias crecidas en ausencia y presencia de RIF, seguidas de la determinación del CMI y el secuenciamiento del gen rpoB. Este enfoque confirmó que el secuenciamiento podía identificar con éxito poblaciones heterorresistentes específicas, destacando el papel crucial de un diagnóstico preciso para garantizar un tratamiento eficaz. En la segunda parte de la tesis, se realizó un estudio in silico e in vitro sobre las formas nativa y mutante de la proteína PonA1, una proteína de unión a penicilina que se hipotetiza por estar involucrada en los mecanismos de resistencia a la RIF. Las proteínas recombinantes nativa y mutantes se clonaron, expresaron en E. coli Rosetta y se caracterizaron biofísicamente. La afinidad entre PonA1 y la RIF se evaluó utilizando espectroscopía de resonancia magnética nuclear por diferencia de transferencia de saturación (STD-NMR). Además, se generó un knockout del gen MMAR_0069, homólogo de ponA1 en Mmar, mediante recombinación mediada por oligos seguida del direccionamiento de la integrasa BxB1 (por sus siglas en inglés ORBIT), con modificaciones en el plásmido de carga. Se realizaron ensayos de complementación introduciendo las formas nativa y mutante de ponA1 de Mtb en las cepas KO. En estas cepas complementadas se evaluaron la determinación de la CMI, los cambios morfológicos (longitud celular, ancho y grosor de la envoltura celular) y la viabilidad celular tras la exposición a la RIF. Finalmente, esta tesis presenta un proyecto colaborativo realizado durante mi estancia en el Centre de Biochimie Structurale, donde se desarrolló una herramienta bioinformática llamada SecretoMyc. Esta herramienta facilita la predicción de proteínas secretadas en Mtb y proporciona información sobre proteínas homólogas enM. bovis, M. smegmatis, Mmar, M. abscessus y M. avium en tres sistemas de secreción: SEC, TAT y T7SS. En conclusión, esta tesis aporta nuevas técnicas de manipulación genética para micobacterias y ofrece herramientas para el estudio y control de la TB.
Resumen
Mycobacterium tuberculosis (Mtb) remains one of the deadliest pathogens worldwide, despite being a preventable disease. Tuberculosis (TB) is treated with a combination of four first-line antitubercular drugs: rifampicin (RIF), isoniazid, pyrazinamide, and ethambutol, in drug-susceptible cases. Among these, RIF is one of the most potent agents for controlling the disease. However, resistance to RIF results in the emergence of rifampicin-resistant (RR-TB) or multidrug-resistant tuberculosis (MDR-TB) cases. The primary mechanism of resistance involves mutations in the rpoB gene, which accounts for approximately 95% of cases. Nevertheless, other molecular mechanisms and conditions that could contribute to the spread of RR-TB and MDR- TB are still being identified. This doctoral research first focuses on a retrospective analysis of whole-genome sequences from clinical isolates of TB patients. Through bioinformatic analysis, heteroresistant populations to RIF were detected and experimentally confirmed in a pilot study by reactivating primary culture. Key assays such as the agar proportion method (APM), test endpoint minimum inhibitory concentration (TEMA MIC), and microscopic-observation drug-susceptibility (MODS) indirect assay were employed for strain characterization. Additionally, for each primary culture, colonies grown in the absence and presence of RIF were isolated, followed by MIC determination andrpoB gene sequencing. This approach confirmed that sequencing could successfully identify specific heteroresistant populations, underscoring the critical role of accurate diagnosis in ensuring effective treatment. In the second part of the thesis, an in silico and in vitro study was conducted on the wild-type and mutant forms of the PonA1 protein, hypothesized to be involved in RIF resistance mechanisms. Recombinant wild-type and mutant proteins were cloned, expressed in E. coli Rosetta, and biophysically characterized. The affinity between PonA1 and RIF was evaluated using saturation transfer difference by Nuclear Magnetic Resonance spectroscopy (STD-NMR). Moreover, a knockout of the MMAR_0069 gene, the ponA1 homolog, in M. marinum (Mmar), was generated using Oligo-mediated recombineering followed by BxB1 integrase targeting (ORBIT), with modifications in the payload plasmid. Complementation assays were performed by introducing the wild-type and mutant forms of Mtb ponA1 into the Knock-out (KO) strains. MIC determination, morphological changes (cell length, width, and cell envelope thickness), and cell viability upon RIF exposure were evaluated in these complemented strains. Lastly, this thesis presents a collaborative project undertaken during my stay at the Centre de Biochimie Structurale, where a bioinformatic tool called SecretoMyc was developed. This tool facilitates the prediction of secreted proteins in Mtb and provides homologous protein information for M. bovis, M. smegmatis, M. marinum, M. abscessus, and M. avium across three secretion systems: SEC, TAT, and T7SS. In conclusion, this thesis contributes novel genetic manipulation techniques for mycobacteria and provides tools for the study and control of TB.
Resumen
Mycobacterium tuberculosis (Mtb) reste l'un des agents pathogènes les plus meurtriers au monde, malgré le fait qu'il s'agisse d'une maladie évitable. La tuberculose (TB) est traitée avec une combinaison de quatre médicaments antituberculeux de première ligne : la rifampicine (RIF), l'isoniazide, la pyrazinamide et l'éthambutol, dans les souches sensibles aux médicaments. Parmi ces médicaments, la RIF est l'un des agents les plus puissants pour contrôler la maladie. Cependant, la résistance à la RIF entraîne l'émergence de cas de tuberculose résistante à la rifampicine (RR-TB) ou multirésistante (MDR-TB). Le principal mécanisme de résistance implique des mutations dans le gène rpoB, responsable d'environ 95 % des cas. Néanmoins, d'autres mécanismes moléculaires et conditions pouvant contribuer à la propagation des populations RR-TB et MDR-TB sont encore en cours d'identification. Cette recherche doctorale se concentre d'abord sur une analyse rétrospective des séquences génomiques complètes d'isolats cliniques de patients atteints de TB. Grâce à une analyse bio-informatique, des populations hétérorésistantes à la RIF ont été détectées et confirmées expérimentalement dans une étude pilote par réactivation des cultures primaires. Des tests clés tels que la méthode de proportion sur gélose, le test de concentration minimale inhibitrice (CMI) et le test indirect de sensibilité aux médicaments par observation microscopique ont été utilisés pour la caractérisation dessouches. En outre, pour chaque culture primaire, des colonies ont été isolées sur des milieux avec et sans RIF, suivies par la détermination de la CMI et le séquençage du gène rpoB. Cette approche a confirmé que le séquençage pouvait identifier avec succès des populations hétérorésistantes spécifiques, soulignant l'importance d'un diagnostic précis pour garantir un traitement efficace. Dans la deuxième partie de la thèse, une étude in silico et in vitro a été réalisée sur les formes sauvage et mutante de la protéine PonA1, a protéine de liaison à la pénicilline que dont on suppose qu9elle est impliquée dans les mécanismes de résistance à la RIF. Les protéines recombinantes sauvage et mutantes ont été clonées, exprimées dans E. coli Rosetta, puis caractérisées biophysiquement. L'affinité entre PonA1 et la RIF a été évaluée à l'aide de la différence de transfert de saturation par spectroscopie de résonance magnétique nucléaire (STD-NMR, pour son acronyme en anglais). De plus, un knockout du gène MMAR_0069, homologue de ponA1, chez Mycobacterium marinum (Mmar), a été réalisé à l'aide de la recombinaison médiée par oligos suivie du ciblage par intégrase BxB1 (ORBIT, pour son acronyme en anglais), avec des modifications dans le plasmide de charge utile. Des essais de complémentation ont été réalisés en introduisant les formes sauvage et mutante de ponA1 de Mtb dans les souches KO. La détermination de la CMI, les changements morphologiques (longueur, largeur cellulaire et épaisseur de l'enveloppe cellulaire) et la viabilité cellulaire après exposition à la RIF ont été évalués dans ces souches complémentées. Enfin, cette thèse présente un projet collaboratif réalisé lors de mon séjour au Centre de Biochimie Structurale, où un outil bio-informatique appelé SecretoMyc a été développé. Cet outil facilite la prédiction des protéines sécrétées chez Mtb et fournit des informations sur les protéines homologues chez M. bovis, M. smegmatis, Mmar,M. abscessus et M. avium dans trois systèmes de sécrétion : SEC, TAT et T7SS. En conclusion, cette thèse apporte des techniques novatrices de manipulation génétique des mycobactéries et fournit des outils pour l'étude et le contrôle de la tuberculose.