Expresión, caracterización bioquímica y determinación de actividad fibrinolítica de la proteína recombinante FhT (rFhT)

Abstract

La proteína FhT es una cisteína proteasa con actividad fibrinolítica in vitro. La purificación de esta enzima de su organismo de origen resulta en cantidades limitadas y una baja pureza, además de ser un proceso costoso y laborioso. En esta investigación, empleamos tecnología de ADN recombinante para superar estas limitaciones. El objetivo fue producir la proteína FhT en su forma recombinante y evaluar su actividad fibrinolítica in vitro. Se clonó el gen de la forma zimógena de FhT (rProFhT) en el vector pPICZαC y se recombinó con el genoma de Pichia pastoris X-33. Se expresó rProFhT de 37 kDa y se purificó con un rendimiento de 20 mg/L. La activación de rProFhT a su forma enzimáticamente activa (rFhT) de 25 kDa se logró mediante la incubación con 10 mM de DTT y 1 mM de EDTA a pH 5 durante 8 horas. La enzima alcanzó su actividad óptima a un pH de 5 y mantenía actividad a pH 7 con el sustrato Z-Phe-Arg-pNA. Los parámetros cinéticos de la rFhT con este sustrato fueron Vmax 1.79 x 10-3 μmoles/min y Km 76.67 μM, valores similares a los de la enzima nativa FhT (Vmax 1.15 x 10-3 μmoles/min y Km 94.14 μM). Además, la enzima rFhT demostró actividad en la degradación de coágulos in vitro, comparables a los resultados obtenidos con la FhT nativa. En conclusión, se expresó y caracterizó bioquímicamente un nuevo agente trombolítico recombinante, rFhT, que muestra potencial para su desarrollo y evaluación como agente para el tratamiento de la trombosis.

The protein FhT is a cysteine protease with in vitro fibrinolytic activity. The purification of this enzyme from its original organism results in limited quantities and low purity, in addition to being a costly and laborious process. In this research, we employed recombinant DNA technology to overcome these limitations. The objective was to produce the FhT protein in its recombinant form and evaluate its fibrinolytic activity in vitro. The gene for the zymogen form of FhT (rProFhT) was cloned into the pPICZαC vector and recombined with the genome of Pichia pastoris X-33. rProFhT, a 37 kDa protein, was expressed and purified with a yield of 20 mg/L. The activation of rProFhT to its enzymatically active form (rFhT) of 25 kDa was achieved by incubation with 10 mM DTT and 1 mM EDTA at pH 5 for 8 hours. The enzyme reached its optimal activity at pH 5 and retained activity at pH 7 with the substrate Z-Phe-Arg-pNA. The kinetic parameters of rFhT with this substrate were Vmax 1.79 x 10-3 μmoles/min and Km 76.67 μM, values similar to those of the native FhT enzyme (Vmax 1.15 x 10-3 μmoles/min and Km 94.14 μM). Additionally, rFhT demonstrated activity in degrading clots in vitro, comparable to the results obtained with the native FhT. In conclusion, a new recombinant thrombolytic agent, rFhT, was expressed and biochemically characterized, showing potential for development and evaluation as a treatment for thrombosis.