Amplificaciones seriadas a través de reacciones isotérmicas con Recombinasa Polimerasa y evaluación de la hipótesis de la presión mutacional termodinámica en condiciones mesófilas sin presión de selección

Abstract

La teoría evolutiva clásica propone que las mutaciones ocurren principalmente de manera aleatoria y que la selección natural determina posteriormente su destino evolutivo. Sin embargo, modelos basados en termodinámica estadística han sugerido que las propiedades fisicoquímicas del ADN podrían introducir sesgos intrínsecos durante el proceso de replicación. En particular, la hipótesis de la presión mutacional termodinámica plantea que las diferencias de estabilidad energética entre los pares de bases influyen en la probabilidad de incorporación de nucleótidos, favoreciendo la formación de pares GC frente a AT en ausencia de presión selectiva. El presente estudio evaluó esta hipótesis mediante un modelo experimental de amplificaciones seriadas del ADN con Recombinasa Polimerasa (RPA) a 37 °C. Se seleccionaron tres genes de Escherichia coli con diferentes contenidos iniciales de GC (evgA, ygjV y phnH), los cuales fueron amplificados de manera iterativa, donde cada ronda de amplificación representó una generación del proceso simulado. Los productos obtenidos fueron purificados y secuenciados mediante tecnología Oxford Nanopore, alcanzando profundidades de cobertura entre 300,000× y 7,000,000× por generación. Las lecturas obtenidas fueron procesadas mediante un flujo bioinformático que incluyó análisis de variantes, aplicando filtros estrictos de profundidad, frecuencia alélica y balance por hebra. Las mutaciones detectadas se clasificaron según su efecto sobre el contenido GC y se evaluó la trayectoria composicional a lo largo de las generaciones mediante análisis de correlación y regresión ponderada. La amplificación seriada permitió simular múltiples generaciones y detectar mutaciones acumuladas en las poblaciones de ADN. El análisis del espectro mutacional reveló un sesgo neto hacia sustituciones que incrementan el contenido de GC (A/TG/C). Asimismo, el porcentaje de GC mostró una tendencia creciente a lo largo de las generaciones, con pendientes estimadas entre 0.137×10−3 y 0.645×10−3 puntos porcentuales de GC por generación, concordante con la predicción de la hipótesis de presión mutacional termodinámica bajo condiciones sin presión selectiva. En conclusión, los resultados obtenidos aportan evidencia experimental de que las diferencias en la energía potencial de interacción entre el nucleótido entrante y el entorno local del ADN durante la replicación pueden influir en la dirección de la acumulación de mutaciones, particularmente favoreciendo cambios asociados al incremento del contenido GC.

Classical evolutionary theory proposes that mutations occur primarily randomly and that natural selection subsequently determines their evolutionary fate. However, models based on statistical thermodynamics have suggested that the physicochemical properties of DNA could introduce intrinsic biases during the replication process. In particular, the thermodynamic mutational pressure hypothesis states that differences in energy stability between base pairs may influence the probability of nucleotide incorporation, favoring the formation of GC pairs over AT pairs in the absence of selective pressure. This study evaluated this hypothesis using an experimental model of serial DNA amplifications with Recombinase Polymerase (RPA) at 37 °C. Three Escherichia coli genes with different initial GC contents (evgA, ygjV, and phnH) were selected and iteratively amplified, with each round of amplification representing a generation of the simulated process. The resulting products were purified and sequenced using Oxford Nanopore technology, achieving coverage depths between 300,000× and 7,000,000× per generation. The resulting reads were processed using a bioinformatics workflow that included variant analysis, applying strict filters for depth, allele frequency, and per-strand balance. Detected mutations were classified according to their effect on GC content, and the compositional trajectory across generations was evaluated using correlation and weighted regression analyses. Serial amplification allowed for the simulation of multiple generations and the detection of accumulated mutations in the DNA populations. Analysis of the mutational spectrum revealed a net bias toward substitutions that increase GC content (A/TG/C). Similarly, the percentage of GC showed an increasing trendacross generations, with estimated slopes between 0.137×10−3 and 0.645×10−3 percentage points of GC per generation, consistent with the prediction of the thermodynamic mutational pressure hypothesis under conditions without selective pressure. In conclusion, the results obtained provide experimental evidence that differences in the interaction potential energy between the incoming nucleotide and the local DNA environment during replication can influence the direction of mutation accumulation, particularly favoring changes associated with increased GC content.