Generación de anticuerpos VHH de alpaca contra proteína recombinante “Core” del virus de hepatitis B

Abstract

La hepatitis B (HB) es una enfermedad viral que provoca aproximadamente la muerte de 620 mil-1 millón de personas al año en todo el mundo. El virus de hepatitis B (VHB) está estructuralmente conformado por una envoltura externa con proteínas llamadas superficie (HBsAg) y una núcleocápside icosaédrica formada a partir de proteínas llamadas core (HBcAg). Aunque en la actualidad no hay un tratamiento adecuado se han desarrollado nuevas terapias entre las que se incluyen anticuerpos neutralizadores de HBsAg en fase clínica I. Respecto a los anticuerpos VHH producidos en camélidos éstos se reportan como agentes neutralizantes contra otros virus humanos tales como hepatitis C, rabia, VIH, polio, influenza, sincitial respiratorio, etc. Los VHH presentan ciertas ventajas sobre los anticuerpos convencionales como una vida media más larga, mayor solubilidad, menor costo de producción y mayor eficacia por su menor tamaño. El objetivo del presente estudio fue generar anticuerpos VHH en alpaca utilizando como antígeno a la proteína recombinante core del VHB. Como primer paso se indujo la expresión de la proteína recombinante core del VHB (rHBcAg) en cepas de E. coli BL21 y se purificó mediante cromatografía de afinidad y de intercambio iónico. Para la generación de VHH se utilizó como modelo a Vicugna pacos (alpaca), a la que se le inocularon semanalmente de 100-500 μg de rHBcAg por 2.5 meses hasta que se obtuvo el título adecuado de anticuerpos. La respuesta inmune fue monitoreada mediante el ensayo de ELISA indirecto con suero pre inmune y los sueros obtenidos semanalmente. A partir de sangre periférica se purificaron las células mononucleares y luego se aisló el ARN, se sintetizó ADNc mediante RT-PCR y luego se realizó una PCR con cebadores específicos para amplificar solamente las secuencias de los VHH. Los amplicones fueron ligados dentro del fagémido pHEN2 que se usó para transformar a cepas de E. coli competentes por electroporación. Se obtuvo una biblioteca inmune genómica de 4 x 108 UFC que expresaron las secuencias nucleotídicas de los VHH. Mediante la técnica de presentación de fagos se generó una biblioteca de fagos recombinantes de 2 x 106 que expresaron a los anticuerpos VHH específicos contra rHBcAg. Se evaluaron 96 fagos usando como control negativo a BSA, de los cuales se seleccionaron y aislaron 21 fagos específicos (21.88 %) contra rHBcAg. Se analizaron las secuencias mediante herramientas bioinformáticas (MEGA 5). Luego del análisis de las 21 secuencias nucleotídicas diferentes éstas fueron traducidas in sillico y se obtuvieron 10 secuencias aminoacídicas putativas de las cuales 7 mostraron menor grado de hidrofobicidad, lo que sería muy ventajoso para su manipulación si fueran utilizados en terapia como agentes neutralizantes o en inmunodiagnóstico. En base a lo encontrado se sugiere continuar con investigaciones sobre las posibles aplicaciones de los VHH.