Estandarización de una PCR multiplex en tiempo real para el diagnóstico de leptospirosis y malaria

Abstract

Varias de las enfermedades con etiología infecciosa causada por una variedad de patógenos cursan inicialmente con síndrome febril agudo (SFA) y han sido reconocidos como un grupo importante de enfermedades que es difícil de diferenciar debido a su similitud en los síntomas. Los SFA como malaria producida por P. falciparum, malaria producida por P. vivax y leptospirosis deben ser consideradas como sospecha principal en áreas tropicales debido a la alta prevalencia y mortalidad. Los índices de letalidad debido a la falta de un diagnóstico oportuno son altos entre los pacientes con malaria por P. falciparum y leptospirosis. Se han reportado problemas en el diagnóstico de malaria debido al desarrollo de infecciones con bajo nivel de parasitemia. Además, se ha reportado problemas en la detección de infecciones mixtas de malaria y no detección de coinfecciones de malaria y leptospirosis. Así, la OMS ha recomendado el desarrollo de un método qPCR-Multiplex para identificar simultáneamente y en una sola reacción diferentes patógenos. La presente investigación, diseñó y estandarizó una PCR Multiplex en tiempo real denominado “qPCR-Multiplex FVL”, capaz de identificar simultáneamente P.falciparum, P.vivax y Leptospira spp. Se diseñaron cebadores y sondas para identificar simultáneamente infecciones con bajo nivel de parasitemia usando secuencias subteloméricas de múltiples copias, Pfr364 para P.falciparum, Pvr47 para P.vivax y el gen Rrs (16S ARNr) para identificar Leptospira spp. El “qPCR-Multiplex FVL” amplificó simultáneamente con éxito las tres dianas Pfr364, Pvr47 y Rrs, manteniendo su eficiencia de amplificación a pesar del formato de multiplexación. El análisis de regresión con la construcción de curvas estándares mostró valores de eficiencia de amplificación de 93 % para Pfr364, 106 % para Pvr47 y 103 % para Rrs con valores de R² > 0,997. Además, mostró un límite de detección altamente sensible adecuado para identificar niveles tan bajos como 0.46 copias de Pfr364 para P.falciparum, 0.06 copias de Pvr47 para P.vivax y 0.63 copias de Rrs para Leptospira spp. No se encontró reacción cruzada con otros microorganismos relacionados a ambos tipos de patógeno. La presente investigación diseñó y desarrolló una plataforma de “qPCR-Multiplex FVL” eficaz para el diagnóstico de infecciones simples y coinfecciones de malaria y leptospirosis, con el potencial de identificar simultáneamente infecciones de baja densidad parasitaria.

Acute febrile illnesses such as P.falciparum Malaria, P.vivax Malaria, and Leptospirosis should be primarily suspected in tropical areas due to the high prevalence and high fatality rate. Case fatality ratios due to the lack of timely diagnosis are high among patients with P. falciparum Malaria and Leptospirosis. Additionally, P.vivax Malaria and P.falciparum Malaria diagnosis have been reported issues in identifying infections with low-level parasitemia. Furthermore, problems in the detection of mixed malaria infections and non-detection of malaria and leptospirosis coinfections have been reported. Therefore, the WHO has recommended the development of a qPCR-Multiplex method to simultaneously identify different pathogens in a single reaction. In this study, we designed and developed a “Multiplex FVL qPCR” capable of concurrently identifying three targets: Pfr364, Pvr47, and Rrs. Primers and probes were designed to identify concurrently multicopy sequences Pfr364 for P.falciparum, and Pvr47 for P.vivax identification with low-level parasitemia, and Rrs (16S rRNA) for Leptospira spp. identification. This “Multiplex FVL qPCR” assay successfully identified Pfr364, Pvr47, and Rrs concurrently, maintaining its effectiveness despite the multiplexing format. A regression analysis using the multiplex assay showed efficiency values of 93 % for Pfr364, 106 % for Pvr47, and 103 % for Rrs with R² values > 0.997. Also, the Multiplex FVL qPCR assay successfully displayed a highly sensitive limit of detection, suitable for identifying levels as low as 0.46 copies of Pfr364, 0.06 copies of Pvr47, and 0.63 copies of Rrs for P.falciparum, P.vivax, and Leptospira spp, respectively. Additionally, no cross-reaction was detected with another related microorganism. This study presents a promising “Multiplex FVL qPCR” platform for the diagnosis of single and coinfections of malaria and leptospirosis, with the potential to identify concurrently low-density parasites.