Publicación: Diagnóstico rápido point-of-care y asociación entre la vacuna Tdap durante la gestación y la reducción del riesgo de infección con pertussis en infantes de Perú
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Resumen
Pertussis, causado por Bordetella pertussis, continúa siendo un problema en salud pública, a pesar de ser una enfermedad respiratoria inmunoprevenible. En el 2014, se estimó una carga global de 24 millones de casos de pertussis y 161,000 muertes en niños menores de 5 años, siendo los infantes < 3 meses, el grupo con mayor riesgo de complicaciones severas y muerte por pertussis. El diagnóstico de pertussis es un gran desafío debido a la variabilidad en la definición del caso clínico y a la existencia de otros patógenos respiratorios que causan síntomas similares. Aunque la prueba de cultivo es considerada el estándar de oro, presenta baja sensibilidad (12%-60%) y los resultados pueden tomar entre 1-2 semanas. Los métodos moleculares basados en la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (qPCR) son utilizados para la detección y diferenciación de especies de Bordetella. No obstante, estos ensayos son costosos y están dirigidos a secuencias de inserción (IS), que son no específicos de especie; o a dianas de copia única poco sensitivas como la subunidad 1 de la toxina pertussis (ptxS1). Un método alternativo es el ensayo de amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP), que ha resultado ser sensitivo y de bajo costo para el diagnóstico rápido de diferentes etiologías incluyendo pertussis. Sin embargo, LAMP es basado en IS y ptxS1, presentando los mismos problemas de especificidad, por lo que es relevante la identificación de nuevas dianas que mejoren el rendimiento de la prueba. La Organización Mundial de la Salud, recomendó la administración de la vacuna Tétanos, Difteria y Pertussis acelular (Tdap) en el tercer trimestre de gestación a fin de proteger a la población en riesgo. En Perú, esta intervención fue incluida al esquema nacional de vacunación, desde el 2019. A pesar que diversos estudios han demostrado la seguridad y efectividad de la vacuna, éstos han sido realizados principalmente en países desarrollados con diferentes contextos epidemiológicos y con vacunas pertussis acelulares en sus esquemas de vacunación primaria frente a vacunas de células enteras utilizadas en nuestro País. Por lo que es esencial, realizar una vigilancia de la vacuna Tdap y establecer la evidencia de prevención de la infección en la población peruana susceptible. La presente tesis doctoral: 1) desarrolló y validó un ensayo LAMP colorimétrico utilizando una nueva diana uvrD_2 informado por el pangenoma para la detección específica y temprana de B. pertussis; y 2) evaluó la asociación entre la vacunación Tdap durante la gestación y la reducción del riesgo de infección por pertussis en infantes menores de 2 meses en Perú. En la investigación 1, primero, se realizó la secuenciación de los genomas de B. pertussis que circulan en Perú. Estas secuencias fueron comparadas con otros genomas de las subespecies de las Bordetella clásicas, disponibles públicamente en bases de datos, para identificar potenciales dianas específicas de B. pertussis mediante el análisis del pangenoma. De los 31 genes candidatos identificados, el conjunto de cebadores LAMP dirigidos al gen uvrD_2 resultó altamente específico y con el menor tiempo de amplificación para la detección de ADN de B. pertussis. Luego, se utilizó ADN de una muestra clínica de gran tamaño (n=600), para evaluar la sensibilidad y la especificidad diagnóstica del ensayo LAMP, comparado al qPCR multidiana, resultando en 99.7% y 100.0%, respectivamente, con un grado de concordancia de 99.7% entre ambos ensayos. El nuevo ensayo colorimétrico LAMP uvrD_2 es muy sensible y específico para detectar ADN de B. pertussis con una precisión diagnóstica similar al complejo y costoso qPCR multidiana, pero es más rápido, más simple y económico, que lo hace muy útil para el diagnóstico confiable y oportuno de pertussis en la atención primaria de salud. En la investigación 2 se analizaron 50 casos y 150 controles. Nuestros resultados demuestran que los infantes menores de 2 meses cuyas madres fueron vacunadas con Tdap en el tercer trimestre de gestación, tienen un 81% menor riesgo de infección por pertussis que infantes nacidos de madres que no recibieron la vacuna (OR=0.19, intervalo de confianza al 95%: 0.04-0.86), sugiriendo que esta estrategia es efectiva en proteger al infante durante los primeros meses de vida y previo a la inmunización primaria.
Resumen
Pertussis, caused by Bordetella pertussis, continues to be a public health concern, despite being an immunopreventable respiratory disease. In 2014, a global burden of 24 million cases of pertussis and 161,000 deaths in children under 5 years of age were estimated, with infants <3 months being the group with the highest risk of severe complications and death from pertussis. Pertussis diagnosis is a great challenge due to the variability in the clinical case definition and the existence of other respiratory pathogens that cause similar symptoms. Although the culture test is considered the gold standard, it has low sensitivity (12%-60%) and results can take between 1-2 weeks. Molecular methods based on quantitative polymerase chain reaction (qPCR) are usually used for the detection and differentiation of Bordetella species. However, these assays are expensive and targeted to insertion sequences (IS), which are non-species specific; or to single-copy targets, but little sensitive such as pertussis toxin subunit 1 (ptxS1). An alternative method is the loop-mediated isothermal amplification assay (LAMP), which has proven to be sensitive and inexpensive for rapid diagnosis of different etiologies including pertussis. However, LAMP is based on IS and ptxS1, presenting the same specificity problems, so the identification of new targets that improve the performance of the test is relevant. The World Health Organization recommended the administration of the Tetanus, Diphtheria, and Acellular Pertussis (Tdap) vaccine in the third trimester of pregnancy in order to protect the population at risk. In Peru, this intervention was included in the national vaccination scheme, since 2019. Despite the fact that various studies have demonstrated the safety and effectiveness of the vaccine, these have been carried out mainly in developed countries with different epidemiological contexts and with acellular pertussis vaccines in their primary vaccination schedules against whole-cell vaccines used in our country. Therefore, it is essential to carry out surveillance of the Tdap vaccine and establish the evidence of infection prevention in the susceptible Peruvian population. This doctoral thesis: 1) developed and validated a colorimetric LAMP assay using a new pangenome-informed uvrD_2 target for the specific and early detection of B. pertussis; and 2) evaluated the association between Tdap vaccination during pregnancy and reduced risk of pertussis infection in infants under 2 months of age in Peru. In research 1, first, the sequencing of the B. pertussis genomes circulating in Peru was performed. These sequences were compared with other genomes of classical Bordetella subspecies, publicly available in databases, to identify potential B. pertussis-specific targets through pangenome analysis. Of the 31 candidate genes identified, the LAMP primer set targeting the uvrD_2 gene was highly specific and had the shortest amplification time for the detection of B. pertussis DNA. Then, DNA from a large clinical sample (n=600) was used to evaluate the diagnostic sensitivity and specificity of the LAMP assay, compared to multitarget qPCR, resulting in 99.7% and 100.0%, respectively, with a degree of agreement of 99.7% between both assays. The new LAMP uvrD_2 colorimetric assay is highly sensitive and specific for detecting B. pertussis DNA with similar diagnostic accuracy to the complex and expensive multitarget qPCR assay, but it is faster, simpler, and cheaper, making it highly useful for reliable and timely diagnosis of pertussis in primary health care. In research 2, 50 cases and 150 controls were analyzed. Our results show that infants younger than 2 months whose mothers were vaccinated with Tdap in the third trimester of gestation have an 81% lower risk of pertussis infection than infants born to mothers who did not receive the vaccine (OR=0.19, 95% confidence interval: 0.04-0.86), suggesting that this strategy is effective in protecting the infant during the first months of life and prior to primary immunization.