PCR acoplada a CRISPR-Cas12A para la detección de los genes de resistencia CTX-M-15 y floR en Escherichia coli: prueba de concepto

Abstract

Estudios recientes sobre la resistencia antimicrobiana han reportado una alta prevalencia de los genes de resistencia blaCTX-M-15, los cuales producen resistencia a betalactámicos, antibióticos de uso humano, y floR, que confiere resistencia a florfenicol, un antibiótico de uso veterinario, proponiéndolos como biomarcadores de la resistencia antimicrobiana (RAM). Estos genes se encuentran en bacterias E. coli provenientes de muestras de humanos, animales y aguas residuales, acentuando la necesidad de que sean monitoreados. Desafortunadamente, la mayoría de los laboratorios se encuentran limitados de adquirir y mantener equipos de alta tecnología, como las plataformas de secuenciación de próxima generación para el monitoreo de la RAM. En este estudio, se desarrolló una técnica de detección molecular de los genes de resistencia blaCTX-M-15 y floR en E. coli enterotoxigénica (ETEC) basados en la tecnología CRISPR-Cas12a acoplada a la a la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) utilizando equipos básicos, como un termociclador y un transiluminador. Para ello, se diseñaron el ARNcr y los cebadores de las regiones conservadas de los genes de resistencia blaCTX-M-15 y floR, mediante análisis bioinformático. Además, se optimizó un sistema de amplificación de ácidos nucleicos y de detección fluorescente mediante CRISPR-Cas. En la determinación del límite de detección, se demostró que la técnica puede detectar concentraciones de ADN diana tan bajas como 100 aM en una reacción de PCR con 30 ciclos de amplificación y un tiempo de detección de 1.5 horas. Finalmente, al comparar la técnica PCR-CRISPR-Cas12a para los genes de resistencia blaCTX-M-15 y floR con los métodos difusión en disco y la microdilución, respectivamente, nuestros resultados también mostraron una buena concordancia con un índice de kappa de 1 (p < 0.001). La aplicación de la técnica aquí descrito se perfila como una opción prometedora para la detección de genes de resistencia antimicrobiana en entornos con recursos limitados, lo que contribuiría a una mejor vigilancia y control de la RAM.

Recent studies have reported a high prevalence of blaCTX-M-15 resistance genes, which confer resistance to beta-lactam antibiotics used in humans, and floR, which imparts resistance to florfenicol, a veterinary antibiotic. These genes are being proposed as biomarkers for antimicrobial resistance (AMR). They have been found in E. coli from human, animal, and wastewater samples, underscoring the need for monitoring them. Unfortunately, in most laboratories, there are limitations in acquiring and maintaining high-tech equipment like next-generation sequencing platforms for AMR monitoring. In this study, a molecular detection method for blaCTX-M-15 and floR resistance genes in E. coli ETEC was developed using CRISPR-Cas12a technology coupled with polymerase chain reaction (PCR) and basic equipment such as a thermocycler and a transilluminator. CRISPR RNA and primers for the conserved regions of blaCTX-M-15 and floR resistance genes were designed through bioinformatic analysis. Additionally, a nucleic acid amplification and fluorescent detection system was optimized using CRISPR-Cas. The research shows that the system can detect target DNA concentrations as low as 100 aM in a reaction with 30 PCR amplification cycles and a detection time of 1.5 hours. Finally, when comparing the PCR-CRISPR-Cas12a technique for blaCTX-M-15 and floR resistance genes with the disk diffusion and microdilution methods, our results showed good agreement with a kappa index of 1 (p < 0.001). The application of the method shown here is a promising option for detecting antimicrobial resistance genes in resource-limited environments, contributing to better surveillance and control of AMR.