Transcripción procariótica – Estudios biofísicos de las ARN polimerasas de Escherichia coli y Mycobacterium tuberculosis

Abstract

El presente trabajo de suficiencia profesional expone demostraciones del cumplimiento del perfil de egreso de la carrera de biología de la UPCH por parte de Daniel Guerra Giraldez. Los aportes científicos cubren la estructura y paisaje energético del inicio de la transcripción, los efectos del ppGpp en la iniciación y la elongación, y la caracterización de la dinámica de la enzima ARN polimerasa de M. tuberculosis (MtbRNAP). Combinando el uso de pinzas ópticas, nucleótidos marcados, microscopía de fuerza atómica (AFM), y fluorescencia, se ha demostrado el rol preponderante del enrollamiento como determinante de la estabilidad del complejo de iniciación de la transcripción (RPo) en E. coli, donde resulta antagonista a la acción de ppGpp y catalizador de la tanto la apertura del ADN como del escape de promotor. Se discute las perspectivas de estudio sobre la interacción entre el superenrollamiento topológico del ADN y el enrollamiento en complejos de transcripción. Mediante la manipulación de enzimas ARN polimerasas individuales durante la elongación de la transcripción, se realiza la caracterización inicial de la actividad de MtbRNAP y del efecto del ppGpp sobre la enzima de E. coli. Además, para favorecer nuevos estudios en MtbRNAP, se fabricaron dos sistemas de expresión, uno basado en plásmidos con usaje de codones optimizado y otro basado en la integración de genes de M. tuberculosis en el cromosoma de E. coli. Este último produce menos estrés a la bacteria portadora y permitirá el uso de genes reporteros fluorescentes GFP y RFP para cuantificar las actividades de MtbRNAP. El cumplimiento de los aspectos del perfil del biólogo referidos al trabajo interdisciplinario, en equipo, en el marco de la ética y comprometido con el bienestar y el progreso de la sociedad, se respaldan con documentos anexos que sustentan el desempeño profesional del postulante.

The present document seeks to demonstrate the fulfillment of the biologist graduation profile of the UPCH by Daniel Guerra Giraldez. The scientific contributions described here cover the structure and energetic landscape of transcription initiation, the effects of ppGpp on transcription initiation and elongation processes, and the characterization of the M. tuberculosis RNA polymerase enzyme (MtbRNAP) dynamics. Combining the use of optical tweezers, labeled nucleotides, atomic force microscopy (AFM), and fluorescence, we identify DNA wrapping as a contributor to the stability of the transcription initiation complex (RPo) in E. coli, where it is antagonistic to the action of ppGpp and a catalyst for the opening of DNA. A possible interaction between the topological supercoiling of DNA and its wrapping around transcription complexes is discussed. The manipulation of single RNA polymerase enzymes during transcription elongation allowed the initial characterization of MtbRNAP activity and measuring the effect of ppGpp on the E. coli enzyme. Additionally, to favour new studies in MtbRNAP, two expression systems were manufactured, one based on plasmids with optimized codon usage and the other based on the integration of M. tuberculosis genes into the E. coli chromosome. The latter produces less stress to the carrier bacteria and will allow the use of fluorescent reporter genes GFP and RFP to rapidly quantify the activity of MtbRNAP in the presence of inhibitors. The attached documents support the professional performance of the applicant in compliance with the aspects of the biologist's profile referring to interdisciplinarity, teamwork, ethics, and commitment to the well-being and progress of society.