Búsqueda de genes implicados a la alta resistencia a pirazinamida basado en el análisis transcriptómico de Mycobacterium tuberculosis

Abstract

La tuberculosis (TB), enfermedad producida por la bacteria Mycobacterium tuberculosis, es tratada por un conjunto de medicamentos de primera línea incluyendo la pirazinamida (PZA). La PZA es altamente específica y elimina a las micobacterias en su estado semi-latente; sin embargo, aún se desconoce el mecanismo de acción. Las micobacterias resistentes a PZA por lo general presentan mutaciones en el gen pncA que codifica a la proteína pirazinamidasa (Pzasa), la cual transforma a la PZA en su estado activo, ácido pirazinoico (POA), pero se ha podido identificar cepas resistentes con Pzasas activas con ausencia de mutaciones en pncA o con mutaciones que no afectan regiones importantes de la enzima, sugiriendo la presencia de otros mecanismos. El objetivo en el presente trabajo fue identificar genes involucrados en la resistencia a PZA por medio del análisis transcriptómico de la cepa de M. tuberculosis H37Rv cultivada bajo diferentes estados de estrés (pH 6.3 y 7.0 y de 0 y 50 μg/mL de PZA). Las bibliotecas de cDNA generadas a partir del ARN fueron secuenciados en pares terminales (paired-end). Las secuencias se alinearon con el genoma de referencia y las abundancias se cuantificaron utilizando Salmon. El análisis de expresión diferencial se realizó con el paquete edgeR, mientras que el análisis de enriquecimiento génico se realizó con GOseq. Los genes expresados diferencialmente (ED) se identificaron con un logFC ≥ 2 y ≤ -2, y valor p <0,05 umbral. De un total de 3979 genes analizados, se encontraron 13 genes de ED, los cuales están involucrados en actividad similar a las porinas, canales de poro ancho, transportadora transmembrana pasiva y acción antioxidante. El gen Rv0387c de la familia de proteínas PE/PPE, con función probable de porina o transportador de moléculas, podría subexpresarse en presencia de PZA inhibiendo su entrada o salida del POA, aumentando la resistencia a PZA en M. tuberculosis.

Tuberculosis (TB), a disease caused by the bacterium Mycobacterium tuberculosis, is treated by a set of first-line drugs including pyrazinamide (PZA). PZA is highly specific and kills mycobacteria in their semi-dormant state; however, the mechanism of action is still unknown. PZA-resistant mycobacteria usually have mutations in the pncA gene that encodes the protein pyrazinamidase (Pzase), which transforms PZA into its active state, pyrazinoic acid (POA), but it has been possible to identify resistant strains with Pzases active with the absence of mutations in pncA or with mutations that do not affect important regions of the enzyme, suggesting the presence of other mechanisms. The objective in this work was to identify genes involved in resistance to PZA by means of transcriptomic analysis of the M. tuberculosis strain H37Rv cultivated under different stress states (pH 6.3 and 7.0 and 0 and 50 μg/mL of PZA). The cDNA libraries generated from the RNA were sequenced in paired-end pairs. Sequences were aligned to the reference genome and abundances were quantified using Salmon. Differential expression analysis was performed with the edgeR package, while gene enrichment analysis was performed with GOseq. Differentially expressed (DE) genes were identified with logFC ≥ 2 and ≤ -2, and p-value <0.05 threshold. From a total of 3979 genes analyzed, 13 ED genes were found, which are involved in porin-like activity, wide pore channels, passive transmembrane transporter and antioxidant action. The Rv0387c gene of the PE/PPE family of proteins, with a probable porin or molecular transporter function, could be underexpressed in the presence of PZA, inhibiting its entry or exit from the POA, increasing resistance to PZA in M. tuberculosis.