Obtención de determinantes genéticos y producción de Microcina J25 (MccJ25) en laboratorio

Abstract

En la actualidad, se ha visto un auge de bacterias patógenas resistentes a antibióticos. La aparición de bacterias resistentes a antibióticos no solo de uso regular, pero también resistentes a antibióticos de última línea presenta una seria preocupación de salud a nivel global. Debido a esto, han aumentado los esfuerzos para obtener nuevos compuestos antibióticos. Compuestos ya encontrados en el medio ambiente tienden a ser mejores blancos de estudio, debido a su fácil obtención en comparación con la síntesis de compuestos nuevos. En el presente trabajo se intentó gene rar una bacteria que produjera microcina J25 (MccJ25) en el laboratorio para futuros estudios. Se realizó el cribado de 126 aislados de E. coli patogénicas en búsqueda de los determinantes genéticos de microcina J25 (MccJ25) mediante colony PCR. No se encontraron bacterias que arrojaran un diagnóstico positivo en este ensayo, por lo que se diseñó un plásmido, pKM1, con los cuatro genes responsables de la producción de MccJ25 con base en la secuencia reportada por los descubridores originales, Salomón y Farías, en el año 1996. E. coli NEB® Stable transformadas con pKM1 no produjeron el antibiótico en las condiciones de cultivo esperadas. El análisis de la secuencia reportada en 1996 indicó la presencia de una mutación sin sentido que produce la interrupción de la traducción del gen mcjC. E. coli NEB® Stable fue transformada con el plásmido corregido por mutagénesis dirigida mediada por PCR, pKM2, y se procedió a los ensayos antibióticos. Estas bacterias fueron capaces de producir MccJ25 tras 24 horas de cultivo en medio LB sin necesidad de inductor, como se había previsto. Esto muestra la viabilidad del plásmido pKM2 como plásmido productor de MccJ25.

Recently, there has been an increase in antibiotic resistant pathogenic bacteria. The apparition of bacteria resistant not only to first line use antibiotic but also last resort antibiotics is a serious global health concern. This has increased efforts to obtain novel antibiotic compounds. Naturally found compounds tend to be better study targets, as they are easier to obtain than lab-synthetized compounds. In this work, we tried to obtain a bacterium that was able to produce microcin J25 (MccJ25) in lab conditions for future studies. 126 pathogenic E. coli samples were screened by colony PCR (cPCR) for Microcin J25 (MccJ25) genetic determinants. None of these samples gave reliable positive results, so a plasmid with the four genes responsible for production of MccJ25 was designed using the sequence reported by Salomón & Farías, its original discoverers, in 1996. Colonies transformed with this plasmid, named pKM1, produced no detectable antibiotic in the expected culture conditions. Later, we noted that the sequence reported in 1996 was corrected in 2005, so we turned to correcting pKM1 through directed mutagenesis by PCR. This corrected a nonsensical mutation in mcjC gene, responsible for the peptide’s maturation. The corrected plasmid, pKM2, was transformed in NEB stable competent cells and we began antibiotic assays. The bacteria were able to produce MccJ25 after 24h incubation in LB media without inductor as foreseen.