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Desarrollo de una técnica de diagnóstico molecular de Escherichia coli enterotoxigénica (ETEC) en heces basada en la amplificación isotérmica con recombinasa y polimerasa (RPA)

Resumen

Introducción: La Escherichia coli enterotoxigénica (ETEC) causa diarrea en niños menores de 5 años. Su diagnóstico se basa en la detección de las toxinas LT o ST. Actualmente, las técnicas moleculares son usadas, pero su aplicación en campo es difícil. La amplificación isotérmica con recombinasa y polimerasa (RPA) es una técnica reciente que se usa en la detección de varios patógenos. La RPA tiene potencial para su uso en campo porque puede funcionar entre 37° y 42°C, la amplificación es rápida y los reactivos pueden ser almacenados sin refrigeración por varias semanas. Objetivo: Desarrollar un método para el diagnóstico de Escherichia coli enterotoxigénica (ETEC) en muestras de heces mediante la detección simultánea de los genes para las toxinas LT y ST usando la amplificación con recombinasa y polimerasa (RPA). Métodos: Se diseñaron y seleccionaron cebadores o “primers” para los genes que codifican para las toxinas LT y ST (STIa y STIb) adecuados para su detección simultánea por RPA. Los productos de amplificación fueron relevados por electroforesis en gel de agarosa. Los ADN extraídos de la cepa ETEC H10407 y de muestras de heces infectadas con esa cepa fueron usados como control positivo. Las condiciones de reacción óptimas (agitación, temperatura y tiempo) fueron determinadas. La especificidad (ausencia de reacción cruzada con otros patógenos) y la sensibilidad (límite de detección) analíticas fueron evaluadas. Finalmente, se determinó la sensibilidad y la especificidad diagnóstica, y sus intervalos de confianza al 95% (IC 95%), de la técnica de RPA en muestras de heces previamente recolectadas usando la PCR en tiempo real como estándar de oro. Resultados: En total, se diseñaron 32 “primers” para las tres toxinas de ETEC. Para la amplificación con RPA, dos de estos “primers” fueron seleccionados para la toxina LT, mientras que se usaron “primers” previamente reportados para las toxinas STIa y STIb (Guion et al., 2008). Los tres genes pudieron ser amplificados con RPA, pero solo se logró la detección simultánea para LT y STIa. Por otro lado, el paso de agitación no afectó la eficacia de amplificación, la RPA funcionó entre 30 y 50°C y el tiempo mínimo de reacción fue de 5 min. Además, no hubo reacción cruzada con otros enteropatógenos. El límite de detección para los genes de las toxinas LT y STIa fue 10 y 100 UFC/rxn, respectivamente. Finalmente, al evaluar 298 muestras de heces con RPA y PCR en tiempo real, la sensibilidad fue 91.57% (IC 95%: 87.52 – 94.64%) y la especificidad fue 94.59% (IC 95%: 81.81 – 99.34%) para la detección de ETEC. Conclusiones: Se desarrolló una técnica para la detección de ETEC usando RPA. Las condiciones óptimas y los límites de detección están dentro de lo esperado. Las altas sensibilidad y especificidad hacen que la técnica sea adecuada para su uso. Su implementación en campo requiere mejorar la detección del producto amplificado con oligocromatografía.