Estudio de la acumulación de mutaciones puntuales durante el proceso de replicación del ADN y evaluación de la hipótesis de la presión termodinámica mediante un modelo evolutivo in vitro que utiliza un PCR de baja temperatura

Abstract

En el presente estudio se genero un modelo evolutivo lineal basado en ciclos recurrentes de PCR que utiliza un fragmento mutante de la enzima ADN polimerasa I (fragmento Klenow 3' → 5' exo-). Se produjeron siete generaciones de tal forma que todas las secuencias de una determinada generacion tenian como secuencia gpadreh a una misma secuencia de la generacion anterior, siendo la secuencia ancestro primigenia la correspondiente al gen de pirazinamidasa de la cepa H37RV de Mycobacterium tuberculosis. Se registraron las mutaciones que ocurrieron en las secuencias obtenidas en cada generacion y se utilizaron esos datos para evaluar ciertas predicciones de la hipotesis de la presion termodinamica respecto a la tendencia del sistema a generar mutaciones que alteren el % GC en las secuencias con el correr de las generaciones. Asimismo, se utilizaron los datos para evaluar la tendencia del sistema a generar transiciones en contraposicion a transversiones, evaluar la presencia de hotspots en la secuencia y evaluar la influencia de las vecindades inmediatas de un nucleotido sobre la tendencia a generar una mutacion cualquiera o de un tipo especifico. Adicionalmente se realizaron analisis similares con los datos de mutaciones obtenidas en un estudio previo donde se habia generado un modelo evolutivo similar pero utilizando PCR con Taq polimerasa. El fragmento Klenow mutante que se utilizo en esta investigacion mantiene la actividad de polimerasa 5'→ 3' de la ADN polimerasa I pero carece de su actividad exonucleasa 5'→ 3' y de la actividad exonucleasa 3'→ 5', por lo tanto, este fragmento Klenow mutante presenta una mayor tasa de errores en el copiado del ADN respecto al fragmento Klenow silvestre y a diferencia de la Taq polimerasa, cuya actividad se realiza a altas temperaturas, realiza su actividad a 37 ºC. Se encontraron evidencias de que existe un sesgo positivo hacia la produccion de mutaciones Ƴ en un sistema a baja temperatura y exento de presion de seleccion lo cual concuerda con las predicciones de la hipotesis de la presion termodinamica.