Comparación de 2 tratamientos de descontaminación y 3 kits comerciales de extracción de ADN de muestras de esputo de pacientes con Mycobacterium tuberculosis para aplicaciones futuras en secuenciación

Abstract

La determinación molecular de la resistencia en pacientes con tuberculosis (TB) a partir de muestras clínicas es clave para el control de esta enfermedad. Los métodos usados actualmente se basan en kits comerciales que analizan un número limitado de genes. El secuenciamiento masivo de última generación es una herramienta poderosa para conocer la composición genética de cualquier organismo; sin embargo, los resultados dependen de la cantidad y calidad del ADN. La extracción de ADN de muestras clínicas representa un desafío debido a la baja cantidad de bacterias y alta cantidad de contaminantes. En este estudio se comparó la cantidad y calidad del ADN obtenidas de muestras de esputo empleando dos métodos de descontaminación utilizando NaOH-NALC (13,14) y saponina (15,16) y tres kits comerciales de extracción de ADN: ZymoBIOMICS DNA Miniprep Kit (23), Quick-DNA Fungal/Bacterial Miniprep (24) y Quick-DNA Miniprep Plus Kit (25). Asimismo, la cantidad de ADN, la calidad del ADN, la presencia de contaminantes, la relación entre ADN de MTB y humano fueron evaluados, debido a que estos parámetros son críticos porque afectan a la calidad y rendimiento del secuenciamiento. En resumen, esta investigación optimizó los tratamientos de muestras de esputo y métodos de extracción de ADN para aplicaciones futuras de secuenciación.

Molecular determination of resistance in tuberculosis (TB) patients from clinical samples is key to disease control. Currently used methods are based on commercial kits that analyze a limited number of genes. Next-generation massive sequencing is a powerful tool for understanding the genetic makeup of any organism; however, results depend on the quantity and quality of DNA. DNA extraction from clinical samples is challenging due to the low bacterial count and high contaminant content. This study compared the quantity and quality of DNA obtained from sputum samples using two decontamination methods using NaOH-NALC (13,14) and saponin (15,16) and three commercial DNA extraction kits: the ZymoBIOMICS DNA Miniprep Kit (23), the Quick-DNA Fungal/Bacterial Miniprep (24), and the Quick-DNA Miniprep Plus Kit (25). Likewise, DNA quantity, DNA quality, the presence of contaminants, and the ratio of MTB to human DNA were evaluated, as these parameters are critical because they affect sequencing quality and performance. In summary, this research optimized sputum sample treatment and DNA extraction methods for future sequencing applications.