Evaluación de un método de detección de Escherichia coli enterotoxigénica (ETEC) utilizando Chelex – 100 en muestras de heces colectadas en papel filtro

Abstract

La enfermedad diarreica es una de las causas principales de muerte en niños menores de cinco años. Uno de los patógenos involucrados en esta enfermedad especialmente en países de mediano y bajo ingreso es la Escherichia coli Enterotoxigénica (ETEC). En los estudios realizados que implican el uso de muestras fecales para el diagnóstico, existen dificultades en la colecta, transporte y almacenamiento; una alternativa planteada para superar estos problemas es el uso del papel filtro, que permite el almacenamiento de muestras a temperatura ambiente y ocupa menor espacio. Asimismo, existe un amplio número de métodos de extracción de ADN muchos de los cuales están basados en kits que no se ajustan económicamente a las necesidades de los lugares donde la enfermedad diarreica es prevalente. De esta forma, este estudio busca evaluar conjuntamente el uso de muestras de heces en papel filtro y la extracción de su ADN utilizando Chelex – 100 para detectar Escherichia coli enterotoxigénica (ETEC) mediante Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) convencional múltiple. El límite de detección del método propuesto fue 5.8x104 UFC/g. El ensayo de interferencia para determinar especificidad analítica para detectar ETEC y el análisis de los cebadores utilizados mostraron que el método es específico. En el ensayo de precisión se obtuvo un 100% para 3 de los 4 puntos de las diluciones escogidas y se obtuvo un 80% para uno de los puntos mostrado una buena precisión del método. El método propuesto obtuvo en 100% de exactitud al compararlo con la extracción con kit Qiagen a partir de muestras frescas. La detección de ETEC utilizando Chelex-100 y muestras de heces en papel filtro mostró una concordancia de moderada a fuerte (k=0.794) con la detección de ETEC utilizando un kit comercial y muestras de heces frescas. (AU)

Diarrheal disease is one of the leading causes of death in children under five years of age. One of the pathogens involved in this disease especially in middle and low income countries is Enterotoxigenic Escherichia coli. In studies involving the use of fecal samples for diagnosis, there are difficulties in colección, transport and storage; an alternative proposed to overcome these problems is the use of filter paper, which allows the storage of samples at room temperature and takes up less space. Likewise, there are a large number of DNA extraction methods, many of which are based on kits that are not economically adjusted to the needs of places where diarrheal disease is prevalent. Thus, this study seeks to jointly evaluate the use of stool samples on filter paper and their DNA extraction using Chelex - 100 to detect Enterotoxigenic Escherichia coli (ETEC) by conventional multiplex Polymerase Chain Reaction (PCR). The detection limit of the proposed method was 5.8x104 CFU/g. The interference assay to determine analytical specificity to detect ETEC and the analysis of the primers used showed that the method is specific. In the precision test, 100% was obtained for 3 of the 4 points of the chosen dilutions and 80% was obtained for one of the points showing a good precision of the method. The proposed method obtained 100% accuracy when compared to the extraction with Qiagen kit from fresh samples. Detection of ETEC using Chelex-100 and stool samples on filter paper showed moderate to strong agreement (k=0.794) with detection of ETEC using a commercial kit and fresh stool samples. (AU)