Amplificación isotérmica mediada por bucle para la detección colorimétrica de blancos multicopias de Plasmodium vivax y Plasmodium falciparum

Abstract

El diagnóstico temprano y especifico es uno de los principales objetivos en las estrategias para el control de la malaria. El presente estudio evalúa la tecnología de amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP del inglés Loop-mediated isothermal amplification), validando un sistema comercial y desarrollando un sistema LAMP colorimétrico “in house” empleando secuencias de genes multicopia para la detección de Plasmodium vivax y de Plasmodium falciparum mediante la visualización directa del cambio de coloración del indicador rojo neutro de amarillo a fucsia en las reacciones positivas. Los límites de detección (LOD del inglés Limit of detection) de las pruebas desarrolladas se estimaron entre 2.4 y 3.7 parásitos/μl de sangre. El mejor desempeño para la detección de P. vivax, fue obtenido con el blanco de amplificación COX1, mientras que el diseño con el blanco de amplificación Pfr364 fue el más específico para la detección de P. falciparum. En el diagnóstico para P. vivax y P. falciparum, los resultados empleando sangre entera indican que el LAMP colorimétrico “in house” puede detectar entre el 36,6 y 80.2 % de infecciones submicroscópicas. La máxima capacidad de detección se logró empleando ADN purificado con filtros de sílice; sin embargo, una preparación rápida de la muestra (Hervido y Centrifugado), mostro resultados tan confiables como los obtenidos por microscopía en muestras de sangre entera o sangre impregnada en papel filtro.

Early and specific diagnosis is one of the main objectives in malaria control strategies. The present study assesses Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) technology, validating a commercial system and developing an in-house colorimetric LAMP system using multicopy gene sequences to detect Plasmodium vivax and Plasmodium falciparum with direct visualization of the color change of the neutral red indicator from yellow to fuchsia in the positives reactions. The limits of detection (LOD) of the test developed were estimated to be between 2.4 and 3.7 parasites/μl of blood. The best performance for the P. vivax detection was obtained with the COX1 amplification target, while the design with the Pfr364 amplification target was the most specific for P. falciparum detection. In the P. vivax and P. falciparum diagnosis, the results using whole blood sample indicate that the colorimetric LAMP in-house can detect between 36.6 and 80.2% of submicroscopic infections. The maximum detection capacity of colorimetric LAMP in-house was achieved using purified DNA with silica filter; however, a rapid sample preparation (Boil & Spin) showed result as reliable as those obtained by microscopy in samples of whole blood or blood impregnated on filter paper.