Detección molecular de Leishmania spp. subgénero Viannia basada en el sistema CRISPR-Cas12a utilizando como biomarcador el ADN de minicírculos del kinetoplasto (ADNk)

Abstract

La Leishmaniasis tegumentaria americana es una enfermedad infecciosa endémica presente en 19 departamentos del Perú. Leishmania (Viannia) braziliensis es el principal agente etiológico de esta enfermedad en las Américas. La presentación clínica más frecuente es la Leishmaniasis cutánea que provoca lesiones cutáneas ulceradas. La confirmación del diagnóstico presuntivo clínico se basa en la realización de más de una prueba de laboratorio, que puede ser de tipo parasitológica, inmunológica o molecular. Existen diferencias en el grado de sensibilidad y especificidad de estas pruebas, además de que requieren tiempos largos de procesamiento y tienen un costo alto. Recientemente se han desarrollado pruebas de detección molecular de agentes patógenos altamente específicas y sensibles empleando la herramienta CRISPR/Cas donde destaca el sistema CRISPR-Cas12a. En el presente estudio se desarrolló y evaluó un método nuevo de detección molecular de Leishmania (Viannia) spp. basado en el sistema CRISPR-Cas12a en combinación con un paso previo de amplificación por PCR convencional empleando como biomarcador multicopia al ADN de minicírculos del kinetoplasto (ADNk). En la evaluación de la sensibilidad analítica de la prueba PCR/CRISPRADNk el límite inferior de detección fue de 0.05 equivalentes genómicos de parásitos (4.25 fg de ADN) (n=3), lo que constituye un valor con relevancia clínica. Además, la prueba de especificidad mostró que las cepas de referencia representativas de L.(Viannia) spp. generaron una señal distintiva con un promedio del valor de la razón de fluorescencia (ésto es, señal fluorescente de la muestra problema normalizada por la señal fluorescente del blanco de reacción) de 2.287 ± 0.29 en comparación al valor de 0.967 ± 0.08 del grupo de cepas del subgénero L.(Leishmania) a los 20 minutos de la reacción CRISPR (n=4). La diferencia en los valores de la razón de fluorescencia en los grupos evaluados fue estadísticamente significativa (p<0,001; prueba t para datos no pareados). No hubo reacción cruzada con ADN genómico humano ni con ADN de la cepa Y de Trypanosoma cruzi. La prueba PCR/CRISPR-ADNk desarrollada se evaluó en un panel de 49 muestras clínicas. Utilizando como punto de corte el criterio de la ‘media de los valores de la razón de fluorescencia de muestras negativas más 3 desviaciones estándar’ (cutoff =1.151), el 79.6% (39/49) de las muestras resultaron positivas y el 20.4% (10/49) resultaron negativas a detección de ADNk de Leishmania. Se consideró un segundo método de clasificación basado en el porcentaje de positividad (PP) de cada muestra (en relación a un control positivo) a partir de la data de señal fluorescente de la reacción Cas12a y un análisis estadístico para seleccionar el punto de corte de probabilidad óptimo para la clasificación que maximice el índice de Youden; este análisis resultó en la misma clasificación de resultados positivos (n=39; PP>29.995%) y negativos (n=10; PP ≤ 29.995%) que el punto de corte de media + 3DE. Ambos análisis catalogaron a las muestras clínicas con concordancia perfecta comparado con PCR en tiempo real (qPCR-ADNk) empleada como prueba de referencia: se obtuvo 100.0% de concordancia positiva (IC 95%: 91.0-100.0) y 100.0% de concordancia negativa (IC 95%: 72.2-100.0). Se demostró el potencial de la prueba PCR/CRISPR-ADNk como método nuevo de detección molecular de especies de Leishmania (Viannia) de importancia médica en Latinoamérica.

American tegumentary leishmaniasis is an endemic infectious disease present in 19 departments of Peru. Leishmania (Viannia) braziliensis is the main etiological agent of this disease in the Americas. The most common clinical presentation is cutaneous leishmaniasis, which causes ulcerated skin lesions. Confirmation of the presumptive clinical diagnosis is based on the performance of more than one laboratory test, which may be of parasitological, immunological, or molecular type. There are differences in the degree of sensitivity and specificity of these tests, in addition to the fact that they require long processing times and are expensive. Recently, highly specific and sensitive molecular detection tests for pathogens have been developed using the CRISPR/Cas tool, where the CRISPRCas12a system stands out. In the present study, a new method of molecular detection of Leishmania (Viannia) spp. based on the CRISPR-Cas12a system in combination with conventional PCR preamplification was developed and evaluated. The method targets the multi-copy kinetoplast DNA (kDNA) minicircles. In the analytical sensitivity evaluation of the PCR/CRISPR-kDNA assay, the lower limit of detection was 0.05 parasite genome equivalents (4.25 fg of DNA) (n=3), which is a value with clinical relevance. In addition, the analytical specificity evaluation showed that the representative reference strains belonging to the L.(Viannia) subgenus generated a distinctive signal with an average fluorescence ratio (that is, fluorescent signal of the test sample normalized by the fluorescent signal of the notemplate control) of 2.287 ± 0.29 compared to the value of 0.967 ± 0.08 of the group of strains belonging to the L.(Leishmania) subgenus at 20-min time point of the CRISPR-Cas12a assay (n=4). The developed PCR/CRISPR-kDNA assay was evaluated in a panel of 49 clinical samples. Using as a cut-off point the criterion of 'mean fluorescence ratio of negative samples plus 3 standard deviations' (cutoff = 1.151), 79.6% (39/49) of the samples were positive and 20.4% (10/49) were negative for Leishmania DNA detection. A second classification method was considered based on the percentage of positivity (PP) of each sample (relative to a positive control) from the raw fluorescence data of the Cas12a assay and a statistical analysis to select the optimal probability cut-off point for the classification that maximizes the Youden index; this analysis resulted in the same classification of positive (n=39; PP > 29.995%) and negative (n=10; PP 29.995%) results as the mean + 3SD cutoff point. Both analyses classified the clinical samples with perfect agreement compared to a realtime PCR (qPCR-kDNA) assay used as the reference test: 100.0% positive agreement (95% CI: 91.0-100.0) and 100.0% negative agreement (95% CI: 72.2- 100.0). The potential of the PCR/CRISPR-kDNA assay as a new molecular method for detection of species of Leishmania (Viannia) of medical importance in the Latin American region was demonstrated.