Optimización de un sistema recombinante para el monitoreo in vivo de la transcripción de M. tuberculosis

Abstract

Introducción: La investigación de la transcripción de Mycobacterium tuberculosis in vitro resulta laboriosa y compleja pues involucra muchas proteínas interactuando a la vez. En nuestro laboratorio, se diseñó un sistema recombinante que contiene la maquinaria básica de transcripción de M. tuberculosis y es capaz de medir la transcripción in vivo. Sin embargo, nuestro sistema presentó problemas de especificidad (Unión del core de la ARN polimerasa de E. coli y la subunidad σA de M. tuberculosis) y de una sobreexpresión muy alta de la señal fluorescente. Planteamos mejorar el sistema reportero uniendo la subunidad σA a una proteína de unión específica a la ARN polimerasa (ARNP) de M. tuberculosis y obtener así una señal fluorescente diferenciable fácilmente y específica para actividad de la ARNP de M. tuberculosis. Metodología: Se fusionó σA con la subunidad β’ de la ARNP de tuberculosis y por otro lado se fucionó σA con la proteína RbpA (factor de transcripción exclusivo de tuberculosis). Ambas versiones fusionadas, σA-β’ y σA-RbpA) se reemplazaron en nuestro sistema reportero y se midió la transcripción de la enzima ARNP con estas fusiones in vivo mediante fluorescencia. Resultados: Se observó señal fluorescente con ambas ARNPs, la que tiene la fusión σA-β’ y la que tiene σA-RbpA. Los ensayos con la fusión σA-RbpA aún presentan problemas de especificidad (Unión al core de la ARNP de E. coli). Con la fusión σA-β’ se observó mejora en la especificidad y una señal fluorescente claramente diferenciable en comparación con los controles (diferencia > al 100%). Conclusiones: Se logró mejorar la especificidad del sistema reportero de actividad de la ARNP de M. tuberculosis fusionando la subunidad σA con la subunidad β’ de la misma enzima.