Estandarización de técnicas neuroanatómicas y conductuales para evaluar el rol de la proteína priónica en el desarrollo del sistema nervioso del pez cebra

Abstract

La proteína priónica (PrP) es patogénica cuando está anormalmente plegada, causando las llamadas “encefalopatías espongiformes transmisibles”. Además, la evidencia reciente indica que PrP media la muerte neuronal en el mal de Alzheimer. Sin embargo, se sabe muy poco sobre los complejos roles fisiológicos que cumple en su estado natural, haciendo necesario elucidar su contribución a los mecanismos moleculares que subyacen la neurodegeneración. Los embriones de pez cebra (Danio rerio) tienen muchas ventajas como modelo animal: su desarrollo es externo y rápido, son transparentes, se puede obtener muchos de ellos de una sola cruza y poseen alta homología genética y similitudes fisiológicas con humanos. El pez cebra expresa dos proteínas ortólogas de la PrP mamífera: PrP-1, mediando adhesión celular ubicuamente en blástula y gástrula, y PrP-2 que es más parecida a la proteína priónica de mamíferos tanto en su distribución subcelular como en su patrón de expresión en el sistema nervioso, pero de la que se conoce menos. Así, proponemos profundizar el estudio de los roles fisiológicos de la PrP a través del análisis funcional de PrP-2 en embriones de pez cebra. En este proyecto se aplicó dos enfoques experimentales para evaluar efectos a nivel celular y conductual de la disminución (“knockdown”) de PrP-2 inducida por la microinyección de oligonucleótidos antisentido de morfolinos en embriones tempranos: usando inmunohistoquímica y microscopía confocal, visualizamos estructuras neuroanatómicas afectadas en embriones de 24 y 48 horas post-fertilización, experimentos que fueron complementados con estudios conductuales en larvas de 5 y 7 días post-fertilización, dando un posible contexto fisiológico para los fenotipos hallados y sugiriendo nuevos enfoques. Nuestros resultados con ambas técnicas combinadas proporcionan información relevante del funcionamiento de la PrP en el desarrollo neural. En organismos tratados, observamos alteraciones importantes en gangliogénesis y axogénesis, posiblemente por una alterada comunicación celular mediada por PrP con proteínas como N-cadherina o NCAM. Además, se anotaron cambios en patrones de nado, consistente con alteraciones de estructuras o vías mediadas por neurotransmisores como GABA y glutamato. Finalmente, nuestro estudio aporta recomendaciones a tener en cuenta en el futuro para estudiar la función de la PrP.

The prion protein (PrP) is pathogenic when abnormally folded, causing the so-called Transmissible Spongiform Encephalopathies. Current evidence indicates that it also mediates neuronal death in Alzheimer’s disease. Nevertheless, little is known about the complex physiological roles it fulfils in its natural state, making it necessary to elucidate its contribution to the molecular mechanisms that underlie neurodegeneration. Zebrafish (Danio rerio) embryos display many advantages as animal model: they are transparent, develop fast and externally, it is easy to obtain large offspring sizes from one couple and present a high degree of genetic and physiological homology with humans. Zebrafish express two proteins orthologous to the mammalian PrP: PrP-1, which mediates cellular adhesion in blastula and gastrula, and PrP-2, which is more similar to the mammalian PrP in terms of subcellular localization and expression pattern in the nervous system. There is scarce information about PrP-2, though. Thus, this work aims at deepening our knowledge of the physiological roles of PrP via the functional analysis of PrP-2 in zebrafish embryos. In this study, we applied two experimental approaches to evaluate the cellular and behavioural effects of the PrP-2 knockdown induced by microinjection of morpholino oligonucleotides in early embryos. For this, we used immunohistochemistry and confocal microscopy to visualize abnormally-developed neuroanatomical structures in 24 and 48 hours post-fertilization embryos, experiments that were complemented with behavioural analyses in 5 and 7 days post-fertilization larvae, providing a possible physiological context to the neuroanatomical phenotypes identified and suggest further experimental approaches. Our results with both techniques yield relevant information about the function of PrP in neural development. In treated organisms, we observed alterations during gangliogenesis and axogenesis, possibly as a result of disrupted cell communication in turn mediated by the de-regulation of PrP-dependent adhesion proteins like N-cadherin or NCAM. In addition, some changes in larval swimming patterns were noted, consistent with the potential alteration of neuroanatomical structures and pathways mediated by neurotransmitters such as GABA and glutamate. Finally, our work provides recommendations for future studies on PrP function.