Efecto adyuvante de Adyuvax y Resiquimod sobre la expresión relativa del ARNm y producción de citocinas inflamatorias en macrófagos de pollo HD-11 infectados con el virus de Newcastle

Abstract

El futuro del desarrollo de adyuvantes vacunales consiste en la combinación de dos o más de ellos a fin de obtener una potente respuesta inmune en las aves. Resiquimod (R-848), un agonista sintético de TLR-7/8, unido a Adyuvax, un adyuvante a base de fosfatos de calcio, sales de aluminio y magnesio, podrían tener un efecto sinérgico. Por tanto, el objetivo de este estudio fue evaluar in vitro el efecto de la coadministración de Adyuvax y R-848 en la expresión relativa y producción de citocinas proinflamatorias en macrófagos de pollos infectados con virus de la enfermedad de Newcastle (vENC). Mediante el ensayo de MTS se evaluó la citotoxicidad de ambos adyuvantes sobre macrófagos de pollo HD-11, posteriormente las células se estimularon con el vENC y se trataron con dosis de cada adyuvante por 6, 12, 24 y 48 h. Los niveles expresión del ARNm de IL-1β e IFN-γ y la producción de ambas citocinas se evaluaron por cada tiempo de exposición a los diferentes tratamientos de Adyuvax y R-848 mediante PCR y ELISA respectivamente. Paralelamente, se evaluó la expresión génica de iNOS y la producción de óxido nítrico. Se evidenció que cada adyuvante individualmente como en combinación no fueron citotóxicos en las células HD-11. Por otro lado, la combinación de Adyuvax y R-848 mostraron resultados similares al grupo de R-848 solamente ante la expresión relativa de ARN mensajero de IL-1β, IFN-γ, iNOS y la producción de óxido nítrico en células HD-11 infectadas. No se detectó la producción de IL-1β ni IFN-γ. La combinación de Adyuvax y R-848 sólo presentó un efecto sinérgico y con una diferencia estadísticamente significativa a los otros grupos tratados en la expresión relativa de iNOS e IFN-γ a las 12 h y 6 h respectivamente, pero no se sostiene en el tiempo. Se atribuye este efecto a la acción inmunomoduladora de R-848. La integración de estos dos adyuvantes en la formulación de vacunas inactivadas puede ser de utilidad para mejorar la respuesta inmune celular de las vacunas inactivadas en aves.

The future of the adjuvants development for vaccines consists in the combination of two or more of them to obtain a powerful immune response in poultry. Resiquimod (R-848), a synthetic TLR-7/8 agonist, together with Adyuvax, an adjuvant based on calcium phosphates, Al and Mg salts, might have a synergistic effect. Therefore, the objective of this study was to evaluate the effect in vitro of the co-administration of Adyuvax with R-848 on the relative expression and production of proinflammatory cytokines in chicken macrophages infected with virus of Newcastle Disease. Using the MTS assay, the cytotoxicity of both adjuvants on HD-11 chicken macrophages was evaluated. Subsequently, the cells were stimulated with the Newcastle disease virus (vENC) and treated with doses of each adjuvant for 6, 12, 24 and 48 hours. The mRNA expression levels of IL-1β e IFN-γ were evaluated for each exposure time to the different Adyuvax and R-848 treatments by real-time PCR and cytokine production by ELISA. In parallel, iNOS gene expression and nitric oxide production were evaluated. It was shown that the combination of both adjuvants was not toxic to HD-11 cells. On the other hand, the combination of Adyuvax and R-848 showed similar results to the R-848 group regarding the relative expression of IL-1β, IFN-γ, iNOS and nitric oxide production in HD-11 cell line. The combination of Adyuvax and R-848 just presented a synergistic effect and with a statistically significant difference to the other treated groups in the relative expression of iNOS and IFN-g at 12 h and 6 h respectively, but it is not sustained over time. This effect is attributed to the immunomodulatory action of R-848. The integration of these two adjuvants in the formulation of inactivated vaccines can be useful to improve the cellular immune responde of inactivated vaccines in poultry.