Evaluación de la técnica de análisis de fusión de alta resolución para la detección y genotipificación de los genogrupos humanos de sapovirus

Abstract

Introducción: Luego de la introducción de la vacuna de rotavirus, sapovirus ha emergido como una de las mayores causas de gastroenteritis viral especialmente en niños menores de 5 años. Actualmente, el diagnóstico de sapovirus se realiza mediante qPCR, y su tipificación se hace por secuenciamiento. Sin embargo, el acceso a secuenciamiento es limitado y costoso. Por lo tanto, es necesario explorar nuevas técnicas de tipificación. Objetivo: Detectar y genotipificar los genogrupos humanos de sapovirus empleando la técnica de fusión de alta resolución comparándolos con el análisis de secuenciamiento. Materiales y métodos: La detección de sapovirus fue realizada mediante qPCR en muestras de heces. Las muestras positivas se analizaron mediante PCR anidado y el producto de amplificación fue secuenciado. Una muestra de cada genotipo fue clonada en el vector pCR 2.1 TOPO para estandarizar la técnica de HRM y ser usados como curva de referencia de cada genogrupo. La técnica de HRM fue probada con 3 sets de primers para hallar las diferencias más notorias entre las curvas de fusión de los genotipos. Se analizaron 80 muestras para estandarizar la técnica y 25, para realizar un ensayo en ciego. Resultados: Se logró clonar exitosamente los cuatro genogrupos de sapovirus y estandarizar la técnica de HRM. El porcentaje de muestras detectadas empleando HRM de GI fue del 93.3%; de GII, 92.6%; de GIV, 94% y de GV, 83.3%. El porcentaje de muestras amplificadas y correctamente identificadas por HRM fue del 100% de los genogrupos GII, GIV y GV; y 96.4% de GI. Además, la técnica no mostró reacciones cruzadas con otros virus entéricos. Conclusiones: La técnica de fusión de alta resolución permite identificar y diferenciar el genogrupo de sapovirus de muestras de heces y detectar coinfecciones inter-grupo con GII y otro genogrupo de sapovirus.