Producción de ADN polimerasa I ‘Bsu’ y la proteína de unión a hebra simple ‘gp32’ como componentes para una reacción de amplificación isotérmica RPA

Abstract

Las técnicas de amplificación de ácidos nucleicos, como la PCR (reacción en cadena de la polimerasa), detectan el material genético de microorganismos. Tienen un rol crucial para el avance de la biología molecular, diagnóstico y estudio de agentes infecciosos. Al afianzarlas, los estudios epidemiológicos locales y nacionales conducirán al desarrollo de estrategias de salud pública. La pandemia del COVID-19 ha demostrado la importancia de potenciar la producción local de técnicas de bajo costo e implementarlas en zonas de difícil acceso y bajos recursos. Las reacciones isotérmicas son alternativas que podrían cubrir esas necesidades locales, entre ellas está la reacción RPA (recombinase polymerase amplification). El RPA es más rápido, menos costoso y requiere de equipamiento más sencillo en comparación con el PCR. El objetivo de este estudio fue producir dos proteínas recombinantes que forman parte del RPA, la ADN polimerasa Bsu y la gp32; y evaluar la actividad de cada proteína de forma independiente. Se evaluaron las condiciones de tiempo y temperatura para inducción, después se purificaron por cromatografía de afinidad a níquel. Se produjo 1.13 mg de polimerasa Bsu y 32 mg de gp32. La producción de la polimerasa no arrastró inhibidores de RPA y la actividad fue de 4.92 U/uL, cercano a la actividad de la polimerasa Bsu comercializada (5 U/uL). Se midió la unión a ADN hebra simple de la gp32 como la disminución de fluorescencia intrínseca de la proteína. La gp32 producida tuvo una actividad ~93% similar a la distribuida comercialmente.

Nucleic acids amplification assays as PCR (polymerase chain reaction), detect genes from microorganisms. These techniques have a crucial role on molecular biology, diagnosis and study of infectious agents. Innovations and growth of this area helps local and national epidemiological studies to improve strategies to secure public health. The COVID-19 pandemic has shown us the importance to boost up the local production of low-cost detection techniques and implement them in remote and low-income regions. The RPA (recombinase polymerase amplification) is an isothermal amplification technique that could aid to satisfy local necessities because it is faster, less expensive and it requires simple equipment in comparison to PCR. The objective of this study was to efficiently produce two recombinant proteins that are part of the RPA reaction: Bsu DNA polymerase and the single stranded binding protein, gp32. Furthermore, each protein specific activity was calculated. The protein expression parameters of time and temperature induction were factors evaluated and improved, then the proteins were purified by affinity chromatography using a nickel column. It was produced 1.13 mg of Bsu DNA polymerase and 32 mg of protein gp32. Polymerase purification didn’t drag RPA inhibitors and the activity of 0.027 ug polymerase was equal to 4.92 U, almost as the commercial Bsu DNA polymerase activity, which is presented at a concentration of 5U/uL. The binding to single stranded DNA by gp32 protein was registered by the reduction of the intrinsic fluorescence of the protein. Protein gp32 locally produced had an activity ~93% identical to the commercial gp32.