Aplicación de partículas de quitosano en el aislamiento in vitro de ADN en orina

Abstract

Introducción: Las desventajas que conlleva la obtención invasiva de muestras biológicas para fines de diagnóstico, hace necesario apuntar hacia el uso de muestras no invasivas como la orina, de fácil obtención y manipulación. No obstante, la baja concentración de ADN y la presencia de sustancias contaminantes limitan el desarrollo de las técnicas de aislamiento convencionales. El quitosano, biopolímero catiónico obtenido por desacetilación de la quitina es capaz de establecer interacciones con moléculas aniónicas como el ADN. El presente estudio tuvo como objetivo evaluar el uso de micropartículas de quitosano entrecruzado para el aislamiento de ADN a partir muestras de orina contaminadas artificialmente. Métodos: Se evaluó la capacidad del quitosano, con diferentes grados de entrecruzamiento (1; 5, y 10%), para adsorber ADN; igualmente se evaluaron los factores que influyen la absorción tales como el pH, tiempo de contacto, cantidad de partículas, la concentración de ADN y los diferentes métodos de desorción del ADN del quitosano. Esta evaluación se realizó mediante la prueba de qPCR empleando como ADN blanco un plásmido conteniendo un inserto el gen de la proteína acuaporina TIP 5:1 de Arabidosis thaliana. Resultados: El mayor grado de adsorción de ADN se observó a un pH igual a 6.9 en los tres tipos de quitosano entrecruzado evaluados. Las micropartículas de quitosano entrecruzado al 1% mostraron la mayor capacidad de adsorción. Los tiempos de contacto (30-120 min) no influyeron sobre esta capacidad de adsorción. La modificación del pH de la orina hacia un pH aproximado de 6.9 favoreció la adsorción de ADN por las micropartículas. El método de desorción con mejores resultados consistió en pretratar las micropartículas con EDTA- SDS y someterlas a ebullición antes de la extracción con fenol-cloroformo. Las micropartículas de quitosano entrecruzado al 1% fueron las únicas capaces de concentrar el ADN añadido a la muestra de orina. Conclusión: Las micropartículas de quitosano entrecruzado al 1% poseen la mejor capacidad de adsorción y concentración de ADN a partir de muestras de orina. La extracción con fenol: cloroformo fue el único método que permitió la desorción del ADN de las micropartículas de quitosano entrecruzado.