Efecto del silenciamiento de los genes que codifican a bombas de eflujo (Rv3756C, Rv1667C y Rv3008) en el eflujo de ácido pirazinoico y en la susceptibilidad a pirazinamida en Mycobacterium tuberculosis

Abstract

Mycobacterium tuberculosis es el agente causante de la tuberculosis, enfermedad que provocó 1,8 millones de muertes en el 2023. La pirazinamida es un fármaco esencial que permite acortar el tratamiento de la tuberculosis a seis meses. Sin embargo, el aumento de cepas resistentes representa una amenaza para el control de la enfermedad. El principal mecanismo de resistencia a pirazinamida se atribuye a mutaciones en el gen pncA, que codifica la enzima pirazinamidasa, encargada de convertir pirazinamida en su forma activa, el ácido pirazinoico (POA).Estudios recientes han sugerido que la velocidad de eflujo de POA también influye en la resistencia a pirazinamida. Se ha demostrado que la sobreexpresión de genes que codifican bombas de eflujo, como Rv0191, Rv3756c, Rv3008 y Rv1667c, puede generar resistencia. Además, una mutación puntual (S292L) en la bomba Rv1258c incrementa el eflujo de POA y la resistencia a pirazinamida, efecto que puede revertirse mediante inhibidores como la piperina. Este estudio evaluó el efecto del silenciamiento transcripcional individual de los genes Rv3756c, Rv3008 y Rv1667c mediante CRISPRi en M. tuberculosis. Se analizó la velocidad de eflujo de POA utilizando la técnica de Wayne y la susceptibilidad a PZA mediante el ensayo “Tetrazolium Microplate Assay” (TEMA). Los resultados mostraron una reducción significativa en los niveles de expresión de Rv3756c y Rv1667c, aunque sin cambios en la velocidad de eflujo de POA ni en la susceptibilidad a pirazinamida, lo que sugiere la posible existencia de mecanismos compensatorios o redundantes en el sistema de eflujo.

Mycobacterium tuberculosis is the causative agent of tuberculosis, a disease responsible for 1.8 million deaths in 2023. Pyrazinamide is an essential drug that shortens tuberculosis treatment to six months. However, the rise of drug-resistant strains poses a serious threat to disease control. The main mechanism of resistance to PZA is attributed to mutations in the pncA gene, which encodes the enzyme pyrazinamidase, responsible for converting pyrazinamide into its active form, pyrazinoic acid (POA).Recent studies have suggested that POA efflux rate also plays a role in resistance to pyrazinamide. Overexpression of efflux pump genes such as Rv0191, Rv3756c, Rv3008, and Rv1667c has been shown to confer resistance. In addition, a point mutation (S292L) in the Rv1258c efflux pump increases POA efflux and pirazinamide resistance, an effect that can be reversed using efflux pump inhibitors such as piperine.This study evaluated the effect of individual transcriptional silencing of the Rv3756c, Rv3008, and Rv1667c genes via CRISPR interference (CRISPRi) in M. tuberculosis. POA efflux rate was analyzed using the Wayne assay, and pirazinamide susceptibility was assessed using the Tetrazolium Microplate Assay (TEMA). The results showed a significant reduction in the expression levels of Rv3756c and Rv1667c, although no changes were observed in POA efflux rate or pirazinamide susceptibility. These findings suggest the possible existence of compensatory or redundant mechanisms within the efflux system.