Estandarización de técnicas moleculares (RT-PCR E IC-RT-PCR) para el diagnóstico de infección por los principales virus que atacan a las uvas pisqueras del Perú

Abstract

Uno de los productos bandera del Perú que ha alcanzado notoriedad y proyección internacional es el pisco, derivado de las “uvas pisqueras” sembradas en los valles de Ica, Lima, Moquegua, Arequipa y Tacna. Su productividad se ve reducida a causa de enfermedades de origen viral, cuyo control se basa exclusivamente en la prevención. A pesar de la gran importancia económica, no se ha realizado hasta la fecha una evaluación fitosanitaria viral rigurosa de este cultivo. Por tal motivo, el objetivo principal de esta tesis se centró en implementar herramientas moleculares altamente sensibles que sirvan para la identificación de los virus de mayor incidencia y prevalencia en nuestras uvas pisqueras. Así, el trabajo se dividió en dos fases: en un principio se determinó la prevalencia, incidencia y distribución de 7 virus de importancia mundial en las regiones de Ica, Arequipa y Tacna. Para ello se analizaron un total de 1207 plantas, pertenecientes a 28 viñedos, con el fin de determinar la presencia de Grapevine fleck virus (GFkV), Grapevine fanleaf virus (GFLV), Grapevine Leafroll associated Virus type 1, 2, 3 (GLRaV-1, GLRaV-2, GLRaV-3), Tomato ringspot virus (ToRSV) y Arabis mosaic virus (ArMV). Se tomaron muestras de hojas al azar en cada viñedo para ser evaluadas serológicamente empleando la técnica DAS-ELISA para los 7 virus evaluados. El mayor valor de incidencia total fue de 7.04% para la infección con GFkV, mientras que el resto de los virus no superó la barrera del 3.5%. Con respecto a los valores máximos de prevalencia, éstos fueron de 71,4 % para GLRaV-2 y 67.9 % para GFkV. Los resultados obtenidos muestran la importancia de los virus GLRaV-2 y GFkV dentro de los parámetros de incidencia y prevalencia. Con esta información se seleccionaron los virus más importantes para dar inicio con la segunda fase: estandarizar técnicas de diagnóstico molecular de detección múltiple por Inmunocaptura (IC) RT-PCR y RT-PCR para la detección paralela de GFkV y GLRaV-2. Para ello se utilizaron cebadores específicos reportados para la amplificación del gen de la proteína de cubierta para GFkV y GLRaV-2 respectivamente. Para confirmar el rendimiento superior de IC-RT-PCR y RT-PCR en la detección de ambos virus, se realizó una comparación con DAS-ELISA con respecto a su sensibilidad y especificidad. Para evaluar la sensibilidad se hicieron diluciones seriadas de 10-1 hasta 10-4 de un extracto de planta con infección múltiple. Se determinó que la técnica IC-RT-PCR es 10 000 veces más sensible que DAS-ELISA y 100 veces más sensible que RT-PCR. A diferencia de RT-PCR que solo fue 100 veces más sensible que DAS-ELISA. La especificidad del PCR se confirmó mediante el secuenciamiento de productos gen de la proteína de cubierta del virus GFkV y GLRaV-2. Las secuencias consenso obtenidas confrontadas en el GenBank obtuvieron porcentajes de identidad mayores al 94% y 99% con los diferentes aislados de los genes reportados del virus GFkV y GLRaV-2 respectivamente. Ambas técnicas moleculares: IC-RT-PCR y RT-PCR, son más sensibles que DAS-ELISA.