Asociación entre la presencia del virus de ARN de Leishmania (LRV1) y la susceptibilidad de aislados clínicos de Leishmania braziliensis a estímulos de estrés oxidativo y nitrosativo

Abstract

El virus endosimbionte de ARN, Leishmaniavirus 1 (LRV1), ha sido identificado frecuentemente en Leishmania braziliensis y L. guyanensis, ambos agentes causales de leishmaniasis cutánea y mucocutánea en el Nuevo Mundo. Se ha demostrado que la presencia de LRV1 en L. guyanensis influencia la gravedad de la enfermedad en modelos murinos. Recientemente, nuestro grupo de investigación encontró una asociación entre la presencia de LRV1 y la falla clínica al tratamiento con antimoniales, en la infección en humanos por L.braziliensis. Se ha hipotetizado que LRV1 le conferiría una ventaja de supervivencia a su hospedero Leishmania, incluyendo una sensibilidad disminuida frente a condiciones de estrés oxidativo y nitrosativo. Con el objetivo de explorar esto, nos enfocamos en aislados clínicos de L.braziliensis con diferente condición de infección por LRV1 (LRV1-positivos o -negativos) y analizamos su susceptibilidad in vitro como amastigotes intracelulares a diferentes tipos de estrés. Seleccionamos 10 aislados de L.braziliensis (previamente caracterizados: 5 LRV1+ y 5 LRV1-) provenientes de diversas regiones endémicas de Perú. Los niveles relativos de transcritos virales fueron estimados usando qRT-PCR, amplificando un segmento del gen que codifica la proteína de la cápside de LRV1 y, paralelamente, el gen G6PD de Leishmania para la normalización (expresado como transcritos de LRV1/G6PD). Se extrajo macrófagos peritoneales de ratón y estos fueron infectados con los parásitos en proporción de 1:10. Luego de 24 horas de infección, se expuso los amastigotes intracelulares a 3 tipos de estrés diferentes: oxidativo y nitrosativo indirecto (antimonio trivalente y pentavalente - SbIII y SbV) y nitrosativo directo (SNAP - un donante de óxido nítrico), por 48 horas. La concentración inhibitoria al 50% (IC50) fue determinada usando un ensayo colorimétrico basado en la actividad de la enzima tripanotión reductasa (TryR) que es exclusiva de tripanosomátidos y el posterior análisis de regresión sigmoidal. Los aislados LRV1+ estudiados mostraron un amplio rango de niveles de transcritos virales (de 10 a 350 transcritos virales por transcritos del parásito). Nuestros datos de susceptibilidad in vitro a los estímulos de estres evaluados sugieren que los parásitos de L.braziliensis LRV1+ tienden a presentar una mejor tolerancia frente a estres nitrosativo directo [SNAP - con medianas de IC50 de 280.1 µM (LRV1+) vs. 73.94 µM (LRV1-)], asi como a establecer una mejor infección in vitro en macrófagos murinos [mediana del porcentaje de infección: 78% (LRV1+) vs. 51% (LRV1-); mediana de índice de infección: 472 (LRV1+) vs. 219.5 (LRV1-)], aunque las diferencias no fueron estadísticamente significativas. Los valores de IC50 frente a la exposicion a SbIII fueron muy dispersos en los dos grupos de aislados, y no se pudo establecer ninguna asociación entre la presencia de LRV1 y la tolerancia de los aislados hacia esta droga. Asimismo, tal como fue previamente reportado, la tolerancia intrínseca de los parásitos hacia SbV no fue diferencialmente influenciada por la presencia de LRV1. Un posterior análisis de los porcentajes de inhibición del crecimiento alcanzados en la máxima concentración de cada droga probada para cada aislado, así como su actividad de TryR basal, tampoco reflejó diferencias significativas entre grupos. En general, estos resultados podrían reflejar la distinta constitución genética de los parásitos (no se usaron líneas isogénicas), así como la condición de infección por LRV1.