Desarrollo de una técnica para el diagnóstico molecular de Escherichia coli enterotoxigénica (ETEC) en muestras de heces basada en la amplificación isotérmica con recombinasa y polimerasa (RPA)

Abstract

Introducción: La Escherichia coli enterotoxigénica (ETEC) causa diarrea principalmente en niños menores de 5 años. Su diagnóstico se basa en la detección de las toxinas termolábil (LT) y/o termoestable (ST). Actualmente, se usan técnicas moleculares basadas en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), pero su aplicación en el punto de atención al paciente es difícil. La amplificación isotérmica con recombinasa y polimerasa (RPA) es una técnica isotérmica reciente que se viene evaluando en la detección de varios patógenos y tiene potencial para su uso en zonas de bajos recursos. Objetivo: El objetivo de este trabajo fue desarrollar un método para el diagnóstico de ETEC en muestras de heces mediante la detección simultánea de los genes para las toxinas LT y ST usando RPA. Métodos: Se diseñaron y seleccionaron primers para los genes codificantes de las toxinas LT y ST (ST-Ia y ST-Ib) adecuados para su detección simultánea por RPA. Se determinaron las condiciones de reacción óptimas (temperatura y tiempo) y se evaluaron la especificidad (ausencia de reacción cruzada con otros patógenos) y la sensibilidad (límite de detección) analíticas. Se determinó la sensibilidad y la especificidad diagnóstica de la técnica de RPA en 298 muestras de heces previamente recolectadas usando la PCR en tiempo real como estándar de oro. Resultados: Se diseñaron 32 primers para las tres toxinas de ETEC. Para la amplificación con RPA, se seleccionaron 2 primers para LT, mientras que se usaron primers previamente reportados para ST-Ia y ST-Ib. Los tres genes pudieron ser amplificados con RPA; sin embargo, no se pudo secuenciar los productos para corroborar. Solo se logró la detección simultánea para LT y ST-Ia. La RPA funcionó entre 30°C y 50°C y el tiempo mínimo de reacción fue de 5 min. No hubo reacción cruzada con otros enteropatógenos. El límite de detección para los genes de las toxinas LT y ST-Ia fue 10 y 100 UFC/rxn, respectivamente. La sensibilidad de la RPA para la detección de ETEC fue 91.57% (intervalo de confianza al 95% [IC 95%]: 87.52 – 94.64%) y la especificidad fue 94.59% (IC 95%: 81.81 – 99.34%). Conclusiones: Se desarrolló una técnica para la detección de ETEC en heces usando RPA. La sensibilidad y especificidad analíticas son óptimas. La alta sensibilidad y especificidad diagnósticas hacen que la técnica sea adecuada para su uso. Su implementación en el punto de atención requiere algunas modificaciones a la técnica reportada en este estudio, así como la validación por secuenciación.