La tuberculosis (TB) es una enfermedad infecciosa causada por la bacteria Mycobacterium tuberculosis. El tratamiento recomendado para combatir la TB en adultos se basa en el uso de drogas de primera línea, como la pirazinamida (PZA). La PZA es usada también en el tratamiento de TB multidrogo resistente (MDR-TB) debido a que su función principal es la erradicación de cepas en estado de latencia. En la actualidad aún no se conoce del todo el mecanismo de acción de la forma activa de la PZA, el ácido pirazinoico (POA). La principal causa de resistencia a PZA son las mutaciones en el gen pncA; gen que codifica a la pirazinamidasa y convierte la PZA en POA; sin embargo, existen cepas resistentes a PZA que son independientes de esta condición, por lo que se cree que existen otros mecanismos que pueden explicar la resistencia como mutaciones en las bombas de eflujo. El objetivo del estudio fue silenciar mediante CRISPR de interferencia a genes que codifican a bombas de eflujo relacionadas al eflujo de ácidos débiles y evaluar la velocidad del eflujo del POA en M. smegmatis mediante la prueba de Wayne cuantitativo. Se seleccionaron genes que codifican a las proteínas relacionadas con la función de bombas de eflujo homólogas en M. tuberculosis. Los genes fueron silenciados en forma simple (MSMEG_0250, MSMEG_3815, MSMEG_0241, MSMEG_5046 y MSMEG_0410) y en combinación de 2 (MSMEG_3815/ MSMEG_0410, MSMEG_3815/ MSMEG_0250 y MSMEG_3815/ MSMEG_0241). El silenciamiento del gen MSMEG_0250 fue el único que cambió la velocidad del eflujo del POA significativamente (P=0.0006).Tuberculosis (TB) is an infectious disease caused by the bacterium Mycobacterium tuberculosis. The recommended treatment for TB in adults is based on the use of first-line drugs, such as pyrazinamide (PZA). PZA is also used in the treatment of multidrug-resistant TB (MDR-TB) because its main function is the eradication of latent strains. At present, the mechanism of action of the active form of PZA, pyrazinoic acid (POA), is not yet fully understood. The main cause of resistance to PZA is mutations in the pncA gene, a gene that encodes pyrazinamidase and converts PZA to POA; however, there are strains that are independent of this condition, so it is believed that there are other mechanisms that may explain resistance such as mutations in efflux pumps. The aim of the study was to silence by CRISPR interference genes encoding efflux pumps related to weak acid efflux and to evaluate the kinetics of POA efflux in M. smegmatis using the quantitative Wayne test. In addition, genes encoding proteins related to the function of homólogous efflux pumps in M. tuberculosis were selected. The genes were silenced singly (MSMEG_0250, MSMEG_3815, MSMEG_0241, MSMEG_5046 and MSMEG_0410) and in combination of 2 (MSMEG_3815/ MSMEG_0410, MSMEG_3815/ MSMEG_0250 and MSMEG_3815/ MSMEG_0241). Silencing of the MSMEG_0250 gene was the only one that changed the POA efflux significantly (P=0.0006).