Expresión, caracterización bioquímica y determinación de actividad fibrinolítica de la proteína recombinante FhT (rFhT)

Buiza Urdanivia, Yerson Jahel

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Maestría en Bioquímica y Biología Molecular
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dc.contributor.advisor	Espinoza Babilón, José Ronald	es_ES
dc.contributor.author	Buiza Urdanivia, Yerson Jahel	es_ES
dc.date.accessioned	2024-10-23T20:52:09Z
dc.date.available	2024-10-23T20:52:09Z
dc.date.issued	2024
dc.identifier.other	204472	es_ES
dc.identifier.uri	https://hdl.handle.net/20.500.12866/16216
dc.description.abstract	La proteína FhT es una cisteína proteasa con actividad fibrinolítica in vitro. La purificación de esta enzima de su organismo de origen resulta en cantidades limitadas y una baja pureza, además de ser un proceso costoso y laborioso. En esta investigación, empleamos tecnología de ADN recombinante para superar estas limitaciones. El objetivo fue producir la proteína FhT en su forma recombinante y evaluar su actividad fibrinolítica in vitro. Se clonó el gen de la forma zimógena de FhT (rProFhT) en el vector pPICZαC y se recombinó con el genoma de Pichia pastoris X-33. Se expresó rProFhT de 37 kDa y se purificó con un rendimiento de 20 mg/L. La activación de rProFhT a su forma enzimáticamente activa (rFhT) de 25 kDa se logró mediante la incubación con 10 mM de DTT y 1 mM de EDTA a pH 5 durante 8 horas. La enzima alcanzó su actividad óptima a un pH de 5 y mantenía actividad a pH 7 con el sustrato Z-Phe-Arg-pNA. Los parámetros cinéticos de la rFhT con este sustrato fueron Vmax 1.79 x 10-3 μmoles/min y Km 76.67 μM, valores similares a los de la enzima nativa FhT (Vmax 1.15 x 10-3 μmoles/min y Km 94.14 μM). Además, la enzima rFhT demostró actividad en la degradación de coágulos in vitro, comparables a los resultados obtenidos con la FhT nativa. En conclusión, se expresó y caracterizó bioquímicamente un nuevo agente trombolítico recombinante, rFhT, que muestra potencial para su desarrollo y evaluación como agente para el tratamiento de la trombosis.	es_ES
dc.description.abstract	The protein FhT is a cysteine protease with in vitro fibrinolytic activity. The purification of this enzyme from its original organism results in limited quantities and low purity, in addition to being a costly and laborious process. In this research, we employed recombinant DNA technology to overcome these limitations. The objective was to produce the FhT protein in its recombinant form and evaluate its fibrinolytic activity in vitro. The gene for the zymogen form of FhT (rProFhT) was cloned into the pPICZαC vector and recombined with the genome of Pichia pastoris X-33. rProFhT, a 37 kDa protein, was expressed and purified with a yield of 20 mg/L. The activation of rProFhT to its enzymatically active form (rFhT) of 25 kDa was achieved by incubation with 10 mM DTT and 1 mM EDTA at pH 5 for 8 hours. The enzyme reached its optimal activity at pH 5 and retained activity at pH 7 with the substrate Z-Phe-Arg-pNA. The kinetic parameters of rFhT with this substrate were Vmax 1.79 x 10-3 μmoles/min and Km 76.67 μM, values similar to those of the native FhT enzyme (Vmax 1.15 x 10-3 μmoles/min and Km 94.14 μM). Additionally, rFhT demonstrated activity in degrading clots in vitro, comparable to the results obtained with the native FhT. In conclusion, a new recombinant thrombolytic agent, rFhT, was expressed and biochemically characterized, showing potential for development and evaluation as a treatment for thrombosis.	es_ES
dc.format	application/pdf	es_ES
dc.language.iso	spa	es_ES
dc.publisher	Universidad Peruana Cayetano Heredia	es_ES
dc.rights	info:eu-repo/semantics/openAccess	es_ES
dc.rights.uri	https://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/deed.es	es_ES
dc.subject	Trombosis	es_ES
dc.subject	Trombolíticos	es_ES
dc.subject	Pichia Pastoris	es_ES
dc.subject	Activación del Zimógeno	es_ES
dc.title	Expresión, caracterización bioquímica y determinación de actividad fibrinolítica de la proteína recombinante FhT (rFhT)	es_ES
dc.type	info:eu-repo/semantics/masterThesis	es_ES
thesis.degree.name	Maestro en Bioquímica y Biología Molecular	es_ES
thesis.degree.grantor	Universidad Peruana Cayetano Heredia. Escuela de Posgrado Víctor Alzamora Castro	es_ES
thesis.degree.discipline	Bioquímica y Biología Molecular	es_ES
dc.publisher.country	PE	es_ES
dc.subject.ocde	http://purl.org/pe-repo/ocde/ford#1.06.03	es_ES
renati.author.dni	71309420
renati.type	https://purl.org/pe-repo/renati/type#tesis	es_ES
renati.level	https://purl.org/pe-repo/renati/level#maestro	es_ES
renati.discipline	917067	es_ES
renati.juror	Colarossi Salinas, Ana Cecilia	es_ES
renati.juror	Maita Malpartida, Holger	es_ES
renati.juror	Evangelista Falcón, Wilfredo	es_ES