Neisseria gonorrhoeae produce infecciones de transmisión sexual a nivel mundial. El aumento de cepas resistentes a los antibióticos de primera línea – azitromicina y cefalosporinas – la han convertido en una preocupación de importancia global. Las mutaciones puntuales en los genes 23S ARNr y penA de N. gonorrhoeae confieren resistencia a antibióticos y pueden ser detectadas mediante ensayos moleculares; sin embargo, en Perú aun no existía información sobre la frecuencia de estas mutaciones. Se analizaron 124 muestras rectales de hombres que tienen sexo con hombres (HSH), colectadas en dos periodos (2013 – 2016 y 2019 – 2021), mediante el ensayo MAMA-qPCR que detecta las mutaciones C2611T y A2059G en el gen 23S ARNr para resistencia a azitromicina y mutaciones en el gen penA para susceptibilidad reducida a ceftriaxona. Además, 27 de estas muestras se sometieron a secuenciamiento por Sanger para identificar mutaciones en los codones del gen penA relacionadas a resistencia a cefixime. Los resultados mostraron que 2 muestras (3.8%) portaban la mutación relacionada a elevada resistencia a azitromicina (A2059G), siendo confirmada en una de las muestras mediante secuenciamiento por Sanger; adicionalmente, no se detectaron mutaciones relacionadas a baja resistencia a azitromicina (C2611T). En el gen penA, D345del y G545S fueron encontradas en 13.5% y 7.4% respectivamente. Adicionalmente, mediante secuenciamiento se detectaron mutaciones relacionadas a susceptibilidad disminuida a cefixime en los codones G375T, A376P y E377K en el 40.7% de las muestras; A501T y P551L en 11.1% y G542S en 3.7%. En este trabajo de investigación se logró detectar mutaciones relacionadas a alta resistencia a azitromicina y susceptibilidad disminuida a cefalosporinas en muestras clínicas de HSH infectados con N. gonorrhoeae. Indicando la circulación de cepas resistentes en la población estudiada y resaltando la importancia del uso de métodos moleculares para optimizar la vigilancia epidemiológica y actualizar protocolos para un tratamiento oportuno de N. gonorrhoeae.Neisseria gonorrhoeae causes sexually transmitted infections worldwide. The emergence of strains resistant to first-line antibiotics – azithromycin and cephalosporins – has become a major concern. Point mutations in the 23S rRNA and penA genes confer resistance and can detected by molecular assays; however, data on prevalence of these mutations in Peru were lacking. We analyzed 124 rectal samples from men who have sex with men (MSM), collected between 2013 – 2016 and 2019 – 2021, using a MAMA-qPCR assay to detect C2611T and A2059G mutations in 23S rRNA gene (azithromycin resistance) and mosaic alleles in penA (decreased susceptibility to ceftriaxone). Additionally, 27 samples were analyzed by Sanger sequencing to identify penA codon mutations linked to cefixime resistance. Two samples (3.8%) carried the A2059G mutation, confirmed by Sanger sequencing in one specimen, while no C2611T mutations were found. In penA gene, D345del and G545S were detected in 13.5% and 7.4% samples, respectively. Sequencing also revealed mutations in codons G375T, A376P and E377K in 40.7%, A501T and P551L in 11.1%, and G542S in 3.7%. This study demonstrates the circulation of high-level azithromycin–and reduced-cephalosporin–susceptible N. gonorrhoeae strains among MSM in our study population, underscoring the value of molecular diagnostics for epidemiological surveillance and the urgent need to update treatment protocols.