La pirazinamida (PZA) es un fármaco esencial en el tratamiento de la tuberculosis por su capacidad de reducir la duración terapéutica. Su metabolito activo, el ácido pirazinoico (POA), puede ser expulsado por bombas de eflujo bacterianas, lo que representa un posible mecanismo alternativo de resistencia en cepas sin mutaciones en pncA. En este estudio, se evaluó el papel funcional de genes homólogos a bombas de eflujo de Mycobacterium tuberculosis en Mycobacterium smegmatis mediante silenciamiento génico por CRISPRi. Se diseñaron y validaron ARNg dirigidos a los genes MSMEG_0232, MSMEG_0241, MSMEG_5046 y MSMEG_6331, utilizando criterios de eficiencia teórica de represión y modelos predictivos de silenciamiento. Además, se midió la expresión relativa de ARNm mediante qPCR, y se evaluó la velocidad de eflujo de POA utilizando el test de Wayne cuantitativo normalizado por proteínas (Bradford). Los datos obtenidos fueron analizados mediante regresión lineal múltiple en R Studio. Los resultados mostraron que MSMEG_0232 actúa directamente en el eflujo de POA, mientras que MSMEG_5046 y MSMEG_6331 presentaron respuestas variables posiblemente asociadas a rutas compensatorias. En cambio, MSMEG_0241 no presentó un impacto fenotípico significativo. Este hallazgo demuestra que el silenciamiento dirigido puede utilizarse para caracterizar bombas de eflujo relevantes en la resistencia a PZA, y propone nuevos blancos terapéuticos preliminares que podrían ser explorados en futuros estudios en M. tuberculosisPyrazinamide (PZA) is an essential drug in tuberculosis treatment due to its ability to shorten the duration of therapy. Its active metabolite, pyrazinoic acid (POA), can be expelled by bacterial efflux pumps, representing a potential alternative mechanism of resistance in strains lacking mutations in pncA. In this study, the functional role of efflux pump homologs from Mycobacterium tuberculosis was evaluated in Mycobacterium smegmatis through gene silencing using CRISPR interference (CRISPRi). Single-guide RNAs (sgRNAs) were designed and validated for the genes MSMEG_0232, MSMEG_0241, MSMEG_5046, and MSMEG_6331, using theoretical repression efficiency criteria and predictive silencing models. Additionally, relative mRNA expression was quantified by qPCR, and POA efflux rate was assessed using the quantitative Wayne assay normalized by protein content (Bradford). Data were analyzed using multiple linear regression in R Studio. Results showed that MSMEG_0232 plays a direct role in POA efflux, while MSMEG_5046 and MSMEG_6331 exhibited variable responses, possibly linked to compensatory pathways. In contrast, MSMEG_0241 showed no significant phenotypic impact. These findings demonstrate that targeted gene silencing can be employed to functionally characterize efflux pumps involved in PZA resistance and identify novel preliminary therapeutic targets for future studies in M. tuberculosis.