Generación de anticuerpos VHH de alpaca contra proteína recombinante “Core” del virus de hepatitis B

Churampi Mancilla, Dalia Violeta

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Maestría en Bioquímica y Biología Molecular
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dc.contributor.advisor	Herrera Velit, Rosa Patricia	es_ES
dc.contributor.advisor	Espinoza Babilon, Jose Ronald	es_ES
dc.contributor.advisor	Gushiken Ibañez, Eduardo	es_ES
dc.contributor.author	Churampi Mancilla, Dalia Violeta	es_ES
dc.date.accessioned	2019-08-12T20:50:07Z
dc.date.available	2019-08-12T20:50:07Z
dc.date.issued	2019
dc.identifier.uri	https://hdl.handle.net/20.500.12866/7176
dc.description.abstract	La hepatitis B (HB) es una enfermedad viral que provoca aproximadamente la muerte de 620 mil-1 millón de personas al año en todo el mundo. El virus de hepatitis B (VHB) está estructuralmente conformado por una envoltura externa con proteínas llamadas superficie (HBsAg) y una núcleocápside icosaédrica formada a partir de proteínas llamadas core (HBcAg). Aunque en la actualidad no hay un tratamiento adecuado se han desarrollado nuevas terapias entre las que se incluyen anticuerpos neutralizadores de HBsAg en fase clínica I. Respecto a los anticuerpos VHH producidos en camélidos éstos se reportan como agentes neutralizantes contra otros virus humanos tales como hepatitis C, rabia, VIH, polio, influenza, sincitial respiratorio, etc. Los VHH presentan ciertas ventajas sobre los anticuerpos convencionales como una vida media más larga, mayor solubilidad, menor costo de producción y mayor eficacia por su menor tamaño. El objetivo del presente estudio fue generar anticuerpos VHH en alpaca utilizando como antígeno a la proteína recombinante core del VHB. Como primer paso se indujo la expresión de la proteína recombinante core del VHB (rHBcAg) en cepas de E. coli BL21 y se purificó mediante cromatografía de afinidad y de intercambio iónico. Para la generación de VHH se utilizó como modelo a Vicugna pacos (alpaca), a la que se le inocularon semanalmente de 100-500 μg de rHBcAg por 2.5 meses hasta que se obtuvo el título adecuado de anticuerpos. La respuesta inmune fue monitoreada mediante el ensayo de ELISA indirecto con suero pre inmune y los sueros obtenidos semanalmente. A partir de sangre periférica se purificaron las células mononucleares y luego se aisló el ARN, se sintetizó ADNc mediante RT-PCR y luego se realizó una PCR con cebadores específicos para amplificar solamente las secuencias de los VHH. Los amplicones fueron ligados dentro del fagémido pHEN2 que se usó para transformar a cepas de E. coli competentes por electroporación. Se obtuvo una biblioteca inmune genómica de 4 x 108 UFC que expresaron las secuencias nucleotídicas de los VHH. Mediante la técnica de presentación de fagos se generó una biblioteca de fagos recombinantes de 2 x 106 que expresaron a los anticuerpos VHH específicos contra rHBcAg. Se evaluaron 96 fagos usando como control negativo a BSA, de los cuales se seleccionaron y aislaron 21 fagos específicos (21.88 %) contra rHBcAg. Se analizaron las secuencias mediante herramientas bioinformáticas (MEGA 5). Luego del análisis de las 21 secuencias nucleotídicas diferentes éstas fueron traducidas in sillico y se obtuvieron 10 secuencias aminoacídicas putativas de las cuales 7 mostraron menor grado de hidrofobicidad, lo que sería muy ventajoso para su manipulación si fueran utilizados en terapia como agentes neutralizantes o en inmunodiagnóstico. En base a lo encontrado se sugiere continuar con investigaciones sobre las posibles aplicaciones de los VHH.	es_ES
dc.format	application/pdf	es_ES
dc.language.iso	spa	es_ES
dc.publisher	Universidad Peruana Cayetano Heredia	es_ES
dc.rights	info:eu-repo/semantics/openAccess	es_ES
dc.rights.uri	https://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/deed.es	es_ES
dc.subject	Virus de la Hepatitis B	es_ES
dc.subject	Camélidos del Nuevo Mundo	es_ES
dc.subject	Antígenos de Superficie de la Hepatitis B	es_ES
dc.subject	Proteínas Recombinantes	es_ES
dc.subject	Anticuerpos de Dominio Único	es_ES
dc.title	Generación de anticuerpos VHH de alpaca contra proteína recombinante “Core” del virus de hepatitis B	es_ES
dc.type	info:eu-repo/semantics/masterThesis	es_ES
thesis.degree.name	Maestro en Bioquímica y Biología Molecular	es_ES
thesis.degree.grantor	Universidad Peruana Cayetano Heredia. Escuela de Posgrado Víctor Alzamora Castro	es_ES
thesis.degree.discipline	Bioquímica y Biología Molecular	es_ES
dc.publisher.country	PE	es_ES
dc.subject.ocde	https://purl.org/pe-repo/ocde/ford#1.06.03	es_ES
renati.type	http://purl.org/pe-repo/renati/type#tesis	es_ES
renati.level	http://purl.org/pe-repo/renati/level#maestro	es_ES
renati.discipline	917067	es_ES