Development of a test associated with magnetic nanoparticles for the diagnosis of tuberculosis

León Janampa, Nancy

dc.contributor.advisor	Sheen Cortavarría, Patricia	es_ES
dc.contributor.advisor	Szlosek-Pinaud, Magali	es_ES
dc.contributor.author	León Janampa, Nancy	es_ES
dc.date.accessioned	2020-06-15T22:19:00Z
dc.date.available	2020-06-15T22:19:00Z
dc.date.issued	2019
dc.identifier.uri	https://hdl.handle.net/20.500.12866/8135
dc.description.abstract	Mycobacterium tuberculosis causes one of the diseases with the highest mortality and morbidity rate in the Americas and around the world. In developing countries, the diagnosis of tuberculosis (TB) is based on smear microscopy and bacteriological cultures. The first method has low sensitivity, and the second take several weeks to reach a confirmatory diagnosis. The lack of a rapid diagnosis compromises the efforts to control TB, favoring its transmission to the susceptible population. Currently, magnetic nanoparticles (MNPs) functionalized with biomolecules have been used in biomedicine, due the magnetic, electrical and optical properties. In this way, applying external magnetic fields, biofunctionalized MNPs are used to detect and concentrate cells and biomolecules from biological samples. In this work we present the synthesis, characterization and bio-functionalization of magnetic nanoparticles to develop a sandwich ELISA assay using MNPs to detect antigens from M. tuberculosis. For this purpose, magnetic nanoparticles were synthesized by the coprecipitation method. The MNP surface was amine-silanized (MNP@Si@NH2) and characterized by physical and chemical methods. The MTB antigens evaluated in this study were: Hsp16.3, CFP10, ESAT6, MTC28, MPT64, 38 kDa protein, Ag85B and MoeX. Cloning and expression of recombinant proteins were expressed in E. coli BL21 (DE3) pLysS system. Polyclonal antibodies were produced in New Zealand rabbits and BALB/C mice, previously immunized with purified recombinant antigens. Specific antibodies (ab) were immobilized in the amine-silanized MNP surfaces (MNP@Si@ab). The MNP@Si@ab were used in a colorimetric sandwich ELISA assay to capture and detect native MTB antigens from sputum samples. The XRD, Mössbauer spectroscopy, zeta potential, TEM and FTIR demonstrated the successful preparation of the MNPs showing a diffraction crystal diameter of ~12.5 nm (10.48 ± 2.56 nm), superficial net charge of ᶎ: +23.57 ± 2.87 mV, characteristic patterns of magnetite and a spherical structure. Additionally, a magnetization saturation of 37.06 emu.g-1 was observed. For the functionalization of nanoparticle surfaces with antibodies, an active ester method was used for peptide bond formation. Parameters such as time of incubation, concentration of coupling agents and surface saturation level of aminesilanized MNPs (MNP@Si@NH2) were standardized. Finally, antibody functionalized on MNPs were used to capture and detect recombinant and native M. tuberculosis antigens in an ELISA-MNP@Si@ab sandwich test in a reaction time <4 h. The ESAT6 and CFP10 antigens were better discriminated in sputum pooles from patients with TB (fold value ~ 1.8). The use of MNP@Si@ab improved the detection of MTB antigens in biological samples with respect to conventional sELISA. Our results are encouraging, but the essay requires additional evaluations such as determining cross-reactions with sputum samples from patients with other infections, performing the test with fresh sputum of TB patients, and determining the clinical sensitivity and specificity of the method.	en_US
dc.description.abstract	Mycobacterium tuberculosis causa una de las enfermedades con la tasa más alta de mortalidad y morbilidad en las Américas y en todo el mundo. En países en vías de desarrollo, el diagnóstico de tuberculosis (TB) se basa en microscopía de frotis y cultivos bacteriológicos. El primer método tiene baja sensibilidad y el segundo toma varias semanas para llegar a un diagnóstico confirmatorio. La falta de un diagnóstico rápido compromete los esfuerzos para controlar la TB, lo que favorece su transmisión a la población susceptible. Actualmente, las nanopartículas magnéticas (MNP) funcionalizadas con biomoléculas se han utilizado en biomedicina, debido a las propiedades magnéticas, eléctricas y ópticas. De esta manera, aplicando campos magnéticos externos, se utilizan MNP bio-funcionalizadas para detectar y concentrar células y biomoléculas a partir de muestras biológicas. En este trabajo presentamos la síntesis, caracterización y bio-funcionalización de las nanopartículas magnéticas para desarrollar un ensayo ELISA sándwich usando MNPs para detectar antígenos de M. tuberculosis. Para este propósito, las nanopartículas magnéticas fueron sintetizadas por el método de co-precipitación. La superficie de MNP fue aminosilanizada (MNP@Si@NH2) y se caracterizada por métodos físico y químicos. Los antígenos de MTB evaluados en este estudio fueron: Hsp16.3, CFP10, ESAT6, MTC28, MPT64, proteína de 38 kDa, Ag85B y MoeX. La clonación y la expresión de las proteínas recombinantes se realizaron en el sistema de E. coli BL21 (DE3) pLysS. Se produjeron anticuerpos policlonales en conejos de Nueva Zelanda y ratones BALB/C, inmunizados previamente con antígenos recombinantes purificados. Se inmovilizaron anticuerpos específicos (ab) en las superficies de MNP amino-silanizadas (MNP@Si@ab). El MNP@Si@ab fue utilizado en un ensayo ELISA sándwich colorimétrico para capturar y detectar antígenos de MTB nativos en muestras de esputo. La XRD, espectroscopia de Mössbauer, la potencial zeta, TEM y FTIR demostraron la preparación exitosa de los MNP, el cual mostró un diámetro de difracción del cristal de ~ 12.5 nm (10.48 ± 2.56 nm), carga neta superficial de ᶎ: +23.57 ± 2.87 mV, patrones característicos de magnetita y una estructura esférica. Además, una saturación de magnetización de 37.06 emu.g-1 fue observada. Para la funcionalización de superficies de nanopartículas con anticuerpos, se utilizó el método del éster activo para la formación de enlaces peptídicos. Parámetros tales como el tiempo de incubación, la concentración de los agentes de acoplamiento y el nivel de saturación de la superficie de las MNPs aminosilanizadas (MNP@Si@NH2) fueron estandarizadas. Finalmente, se usaron MNP funcionalizados con anticuerpos para capturar y detectar antígenos nativos y recombinantes de M. tuberculosis en una prueba sándwich de ELISAMNP@ Si@ab en un tiempo de reacción <4 h. Los antígenos ESAT6 y CFP10 se discriminaron mejor en las muestras de esputo de los pacientes con TB (fold value ~ 1,8). El uso de MNP@Si@ab mejoró la detección de antígenos de MTB en muestras biológicas con respecto a un sELISA convencional. Nuestros resultados son alentadores, pero el ensayo requiere evaluaciones adicionales, como determinar reacciones cruzadas con muestras de esputo de pacientes con otras infecciones, realizar la prueba con esputo frescos de pacientes con TB y determinar la sensibilidad y especificidad clînica del método.	es_ES
dc.format	application/pdf	es_ES
dc.language.iso	eng	es_ES
dc.publisher	Universidad Peruana Cayetano Heredia	es_ES
dc.rights	info:eu-repo/semantics/openAccess	es_ES
dc.rights.uri	https://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/deed.es	es_ES
dc.subject	Tuberculosis Activa	es_ES
dc.subject	Prueba ELISA Tipo Sándwich	es_ES
dc.subject	Nanopartículas Magnéticas Amino-silanizadas	es_ES
dc.subject	Proteínas Recombinantes	es_ES
dc.subject	Anticuerpos Policlonales	es_ES
dc.title	Development of a test associated with magnetic nanoparticles for the diagnosis of tuberculosis	en_US
dc.type	info:eu-repo/semantics/doctoralThesis	es_ES
thesis.degree.name	Doctor en Ciencias de la Vida	es_ES
thesis.degree.grantor	Universidad Peruana Cayetano Heredia. Escuela de Posgrado Víctor Alzamora Castro	es_ES
thesis.degree.discipline	Ciencias de la Vida	es_ES
dc.publisher.country	PE	es_ES
dc.subject.ocde	https://purl.org/pe-repo/ocde/ford#1.06.03	es_ES
renati.type	http://purl.org/pe-repo/renati/type#tesis	es_ES
renati.level	http://purl.org/pe-repo/renati/level#doctor	es_ES
renati.discipline	511098	es_ES