OPTIMIZACIÓN DE LA PRODUCCIÓN DE ETANOL EN LA INDUSTRIA CERVECERA MEDIANTE EL SECUENCIAMIENTO COMPLETO DEL GENOMA DE SACCHAROMYCES CEREVISIAE Trabajo de Suficiencia Profesional para optar el Título Profesional de Licenciado en Biología Autor: Sebastian Luca Morales-Bermudez Espinel Asesor: Prof. Lidio Edgar Neyra Valdez Lima – Perú 2024 ÍNDICE RESUMEN………………………………………………………………….…….……..1 ABSTRACT………………………………………………………………….………….2 1. INTRODUCCIÓN………………………………………………………………….……3 2. METODOLOGÍA……………………………………………………………….…..…...11 3. RESULTADOS………………………………………………………………..….….…13 4. DISCUSIÓN………………………………………………………………..……......…..22 5. CONCLUSIONES…………………………………………………………..………….24 6. RECOMENDACIONES………………………………………………………………….25 7. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS……………………………………………..……26 1 RESUMEN El estudio se enfoca en la implementación del secuenciamiento completo del genoma de las levaduras Saccharomyces cerevisiae en las industrias cerveceras con el objetivo de optimizar la producción de etanol. A través de una exhaustiva revisión bibliográfica, se identificaron genes clave asociados con la producción de etanol, como ADH1, ADH2, PDC1 y HXT1, así como tecnologías como CRISPR-Cas9 y "Genome Shuffling" para modificar e identificar estos genes. Se destacó la importancia de realizar estudios adicionales para validar las variaciones genéticas identificadas y comprender su impacto real en la producción de etanol. Se resalta la necesidad de considerar factores externos que influyen en la fermentación alcohólica, como la composición del sustrato y la presencia de contaminantes microbianos. En conclusión, el secuenciamiento completo del genoma se presenta como una técnica prometedora para desarrollar cepas mejoradas de levadura y optimizar la producción de etanol en la industria cervecera. A través de la recopilación de datos de 11 estudios relevantes de diversas ubicaciones geográficas, se proporciona una visión global del estado actual de la investigación en este campo. Se resalta la necesidad de ampliar los estudios para garantizar la validez y aplicabilidad de los resultados, así como la importancia de abordar una gama más amplia de variables en la optimización de la producción de etanol. Palabras clave: Saccharomyces cerevisiae, Secuenciamiento Genoma completo, Fermentación y Producción de etanol. 2 ABSTRACT The study focuses on the implementation of whole-genome sequencing of the yeast Saccharomyces cerevisiae in the brewing industries with the aim of optimizing ethanol production. Through an exhaustive literature review, key genes associated with ethanol production, such as ADH1, ADH2, PDC1, and HXT1, were identified, along with technologies like CRISPR-Cas9 and genome shuffling for modifying and identifying these genes. The importance of conducting additional studies to validate the identified genetic variations and understand their real impact on ethanol production was highlighted. The need to consider external factors influencing alcoholic fermentation, such as substrate composition and the presence of microbial contaminants, was emphasized. In conclusion, whole-genome sequencing is presented as a promising technique for developing improved yeast strains and optimizing ethanol production in the brewing industry. By compiling data from 11 relevant studies from various geographic locations, a global view of the current state of research in this field is provided. The need to expand studies to ensure the validity and applicability of the results, as well as the importance of addressing a broader range of variables in optimizing ethanol production, is highlighted. Keywords: Saccharomyces cerevisiae, Whole-genome sequencing, Fermentation, Ethanol production. 3 1. INTRODUCCIÓN La fermentación es considerada la biotecnología más antigua y económica descubierta por la humanidad, la cual cuenta con rastros que se remontan a la prehistoria y ha evolucionado a lo largo de los siglos (1). En la actualidad, con la adquisición de nuevas herramientas tecnológicas y conocimientos, hemos logrado revisitar nuestra historia y revitalizar el interés por las biotecnologías ancestrales. Esto posibilita dotar a la fermentación, una de las biotecnologías más antiguas, con nuevas características y mejoras Un campo destacado de la aplicación de la fermentación es la elaboración de bebidas alcohólicas mediante la acción de levaduras, especialmente Saccharomyces cerevisiae, sobre los azúcares presentes en diferentes materias primas como cereales, plantas ricas en sacarosa o frutas. Esta interacción entre levaduras y azúcares ha sido el núcleo de la industria de las bebidas alcohólicas, que ha reinventado la levadura a su conveniencia para obtener productos únicos y deseados. Saccharomyces cerevisiae se destaca como una de las levaduras más predominantes en esta industria (1). En presencia de azúcares y otros nutrientes esenciales, como aminoácidos, minerales y vitaminas, esta levadura realiza el metabolismo fermentativo para producir etanol y dióxido de carbono, que son los metabolitos principales de la fermentación (1). Este proceso tiene lugar mientras las células de levadura luchan por obtener energía y regenerar el coenzima NAD+ en condiciones anaeróbicas. Además de estos metabolitos primarios, en la fermentación se generan diversos metabolitos secundarios, como alcoholes superiores, ésteres y compuestos de azufre, que desempeñan un papel crucial en la formación del sabor y aroma característicos de las bebidas. La importancia de las levaduras, especialmente de S. cerevisiae, radica en su papel vital 4 al proporcionar el contenido de alcohol y los perfiles sensoriales que caracterizan a las bebidas como cerveza, vino, whisky, ron y brandy. Para comprender a fondo los mecanismos genéticos y metabólicos que rigen la fermentación en estas levaduras, se ha llevado a cabo una serie de investigaciones significativas, entre las que se destacan los trabajos de Reiter T et al (2), Davydenko S et al (3), Deed RC et al (4) y Varela C et al (5). Reiter T et al (2) se centraron en el estudio de los patrones de expresión génica de S. cerevisiae durante la fermentación del vino Pinot Noir a una escala industrialmente relevante, utilizando avanzadas técnicas como la secuenciación de ARN (RNA-seq) y el análisis bioinformático. Por otro lado, Davydenko S et al (3) emplearon un enfoque diferente, realizando un análisis proteómico para identificar genes específicos relacionados con la panificación, la elaboración de cervezas y la producción de etanol entre las cepas de Saccharomyces cerevisiae. Reiter T et al (2) identificaron genes clave involucrados en la glicólisis y la fermentación, como HXT3, PFK1, PFK2 y ADH1-5, revelando los mecanismos moleculares que regulan estos procesos. En el caso de Davydenko S et al (3), encontraron varios genes de alcohol deshidrogenasa (ADH1, ADH3, ADH4, ADH5 y SFA1) que desempeñan un papel crucial en la conversión de acetaldehído a etanol durante la fermentación de glucosa. Este enfoque subraya la importancia de comprender la base genética de las cepas de levadura utilizadas en diversas industrias para mejorar su rendimiento y eficiencia. Ambas investigaciones convergieron en la importancia de los genes de alcohol deshidrogenasa (ADH1-5) durante el proceso de fermentación. La investigación liderada por Deed RC et al (4) exploró la relación entre la temperatura de fermentación y los genes que afectan la cinética de fermentación. Estudiaron 121 5 descendientes F1 obtenidos de un cruce entre cepas haploides, identificando un locus de rasgo cuantitativo genéticamente vinculado a la tasa de fermentación. En este locus, encontraron genes como FLO1 y SWH1 vinculados a la mejora de la producción de etanol en condiciones industriales, incluida la resistencia mejorada a factores como el etanol y el ácido acético. Varela C et al (5) se enfocarón en estrategias de modificación génica para crear levaduras de vino con bajo contenido de alcohol, centrándose en la cepa Saccharomyces cerevisiae AWRI1631. A través de la manipulación de la expresión génica y la regulación a la baja de genes vinculados a la producción de etanol, identificaron genes como MDH2 y FRD1 cuya expresión mejorada afectó la formación de ácidos orgánicos y redujo marginalmente la producción de etanol. En la actualidad, uno de los métodos más empleados para obtener levaduras con características deseadas es el genome shuffling. Este enfoque comprende tanto la reproducción sexual como asexual de la levadura, evitando la fusión de protoplastos mediada por glicol de polietileno (9). Tanto la investigación de Hou L (9), como la de Tao X et al (10) utilizaron este método en condiciones de fermentación de alta gravedad (VHG). Hou L (9) aplicó este enfoque con el propósito de mejorar la producción de etanol en cepas industriales de Saccharomyces cerevisiae, cuyas propiedades de fermentación resultan difíciles de alterar con métodos tradicionales debido a la influencia de múltiples genes. Tras llevar a cabo tres rondas de "genome shuffling", se obtuvo la cepa de mejor rendimiento, S3-10, la cual demostró una mejora significativa en la tolerancia al estrés de etanol, glucosa y calor. El ciclo de fermentación de S3-10 se acortó, y el rendimiento de etanol aumentó hasta un 10.96% en comparación con el control en fermentaciones de alta gravedad (VHG). En el estudio de Tao X et al (10), el objetivo fue utilizar métodos de combinación de 6 ingeniería metabólica y recombinación genética para crear cepas de levadura destinadas a la fermentación de alta gravedad (VHG). En la cepa parental Z5, eliminaron mediante ingeniería genética el gen GPD2, que codifica glicerol-3-fosfato deshidrogenasa, con el fin de obtener una cepa con menor rendimiento de glicerol y menor productividad de etanol. Como resultado, obtuvieron la cepa SZ3-1, la cual produjo menos glicerol y aumentó el rendimiento de etanol hasta un 8% en comparación con la cepa parental Z5. Sin embargo, tanto en el caso de Hou L, como en el estudio de Tao X et al, se identificó una brecha en la investigación: ninguna evaluó las variaciones genéticas que pudieron haber ocurrido en las cepas S3-10 o SZ3-1 con respecto a la cepa control/parental. Estas limitaciones forman la base de la problemática que abordaremos en este trabajo. El problema central que motiva este trabajo de investigación radica en las limitaciones observadas en estudios previos, especialmente en la falta de evidencia que demuestre las variaciones genéticas entre cepas mejoradas y sus cepas parentales. Esta ausencia de información genética dificulta la comprensión de la relación entre material genético y mecanismos como la producción de etanol y resistencia a factores de estrés La importancia de abordar este problema recae en la necesidad de la industria de bebidas alcohólicas como la cervecera, que busca constantemente la optimización de procesos y el aumento de eficiencia en su producción. La elaboración de alta gravedad se propone como un método para lograr estos objetivos. Esta técnica, que se originó en la década de 1960 en Estados Unidos, se ha introducido progresivamente en cervecerías de todo el mundo durante los últimos 40 años (11). Consiste en utilizar mosto (cerveza no fermentada) a concentraciones más altas de lo normal, lo que implica una dilución posterior con agua tratada, generalmente desoxigenada, hasta obtener la gravedad o la fuerza alcohólica deseada. El término "High Gravity Brewing" se refiere al proceso de preparar un tipo de mosto 7 fuerte con una alta gravedad original (OG) con la intención de producir una cerveza de alto contenido de alcohol. Generalmente, se considera cerveza de alta gravedad aquella con una OG superior a 1.075. La OG es una medida de sustancias fermentables y no fermentables en el mosto antes de la fermentación, que se mide después de la ebullición inicial y antes de agregar la levadura. Posteriormente, se utiliza junto con la lectura de la gravedad final para calcular el contenido de alcohol. Una OG más alta significa que hay mucha "comida" en el mosto para que la levadura se alimente, produciendo distintos tipos de alcoholes. Bajo condiciones ambientales y de cuidado adecuadas, ciertas cepas de levadura en mosto de alta gravedad específica pueden producir una gran cantidad de alcohol, de ahí que "alta gravedad específica" y "alto contenido de alcohol" sean sinónimos (12). Una ventaja de esta técnica es su capacidad para satisfacer una alta demanda de producción cuando la capacidad de elaboración disponible es limitada, sin necesidad de ampliar las instalaciones existentes de elaboración, fermentación y almacenamiento. En este sentido, un cervecero puede elaborar un mosto de alta gravedad que se convertirá en una cerveza base de alto contenido alcohólico para utilizarse como un concentrado. En los últimos pasos de acabado, el cervecero agrega agua de elaboración desoxigenada para diluir la cerveza de alto contenido alcohólico a una fuerza normal. Procesar un volumen menor de mosto y cerveza, manteniendo al mismo tiempo una producción líquida constante, también resulta en ganancias de eficiencia en el uso de energía, mano de obra, limpieza y costos de efluentes (13). La elaboración de cerveza de alta gravedad se realiza para producir estilos de cerveza con alto contenido alcohólico, como las “Barley” y “Doppelbocks”, una bock alemana, una tripel belga o una barley wine británica, que dependen de toda la gravedad obtenida 8 del mosto. Estos tipos de cervezas son estilos especializados y generalmente no se producen en grandes cantidades. Algunos estilos comunes de cerveza de alta gravedad incluyen “Barley Wine”, “Imperial Porter” / “Imperial Stout”, “Scotch Ale” / “Wee Heavy”, “Imperial IPA”, “Wheat Wine Ale”, Cerveza envejecida en barriles y “Belgian- Style Golden Strong Ale” (14). Aunque algunas fuentes indican que la elaboración de alta gravedad también ofrece flexibilidad en el tipo de cerveza que se puede ofrecer para la venta, permitiendo la producción de varios productos diferentes con extractos originales y niveles de alcohol diversos a partir de un solo "stock" de cerveza de alta gravedad, sin la necesidad de mantener un inventario separado para cada tipo de cerveza. Además, con la aparición de extractos de lúpulo, extractos de malta, jarabes y colorantes naturales producidos con dióxido de carbono y etanol como solventes, la gama potencial de tipos de productos comercializables se expande aún más (11). Lamentablemente, el éxito de esta técnica está estrictamente ligada a la disponibilidad de cepas de levadura capaces de producir altas cantidades de etanol de forma eficiente y a su tolerancia al alcohol. Desde un punto de vista práctico, la obtención de levaduras con características mejoradas, como la eficiencia en la producción de etanol, es esencial para maximizar los beneficios de la técnica de alta gravedad. Aunque el entrecruzamiento se presenta como una opción, abordar la problemática desde una perspectiva genética puede proporcionar resultados más directos al identificar el genotipo necesario para la característica deseada. Una de las soluciones para resolver esta problemática es el uso del secuenciamiento completo del genoma (SCG). La Secuenciación Completa del Genoma (SCG) es una técnica de biología molecular utilizada para determinar la secuencia completa de ADN 9 del genoma de un organismo (15). Esto incluye todos los genes del organismo, así como las regiones no codificantes del ADN que pueden desempeñar un papel en la regulación génica y otros procesos celulares (17). La SCG ofrece una perspectiva completa de la composición genética de un organismo, facilitando un análisis detallado y la comparación de las variaciones genéticas. Esta técnica implica varios pasos clave; en primer lugar, se extrae ADN de alta calidad del organismo de interés, como un cultivo bacteriano o una muestra clínica. Luego, se procesa el ADN extraído para crear una biblioteca, esto implica fragmentar el ADN, los cuales después son secuenciados utilizando tecnologías de secuenciación de alto rendimiento. Finalmente, los datos de secuencia generados se analizan utilizando herramientas de bioinformática para ensamblar la secuencia completa del genoma, identificar variaciones genéticas e interpretar la información genómica (16). Se aplican acciones de control de calidad durante todo el proceso con el fin de asegurar la obtención de resultados precisos y confiables (15). Las investigaciones de Baert L et al (15), Kwong JC et al (16) y Otero JM et al (17), nos han proporcionado un profundo entendimiento de las múltiples aplicaciones de la Secuenciación Completa del Genoma (SCG). Esta tecnología no solo se limita a campos como la medicina, la agricultura, la ciencia ambiental y la biología evolutiva, sino que también ha encontrado un lugar crucial en una diversidad de sectores (17). Investigadores, agencias de salud pública y empresas privadas, incluyendo laboratorios clínicos y la industria alimentaria, se benefician ampliamente de la versatilidad de la SCG (16). Entre los profesionales y organizaciones que hacen uso de esta técnica, se destacan los microbiólogos clínicos, quienes emplean la SCG en la identificación de patógenos, el estudio de la resistencia antimicrobiana y la investigación de brotes de enfermedades. 10 Los laboratorios de salud pública la utilizan para la vigilancia, estudios epidemiológicos y monitoreo de la propagación de enfermedades infecciosas. En instituciones de investigación, la SCG es una herramienta esencial para estudiar la evolución microbiana, factores de virulencia y diversidad genética. Además, las empresas farmacéuticas la emplean en el desarrollo de medicamentos, desde la identificación de posibles objetivos farmacológicos hasta la comprensión de mecanismos de resistencia (16). En la industria alimentaria, la SCG se revela como una herramienta valiosa para el rastreo de origen, investigaciones de brotes y el control de calidad, proporcionando información crucial sobre la relación genética de los aislados microbianos, facilitando la identificación de fuentes de contaminación y permitiendo la implementación de medidas de control específicas (15). En este contexto, la investigación se presenta como una oportunidad para cerrar la brecha de conocimiento y tiene como objetivo sustentar bibliográficamente que el secuenciamiento completo del genoma nos ayudará a identificar cepas de levaduras Saccharomyces cerevisiae con mejor producción de etanol. Para lograr esto, se plantean los siguientes objetivos específicos: primero, identificar investigaciones donde se use secuenciamiento genético en levaduras con el fin de optimizar su producción de etanol; y segundo, sintetizar los datos recopilados de estas investigaciones, incluyendo métodos, resultados obtenidos y limitaciones encontradas. 11 2. METODOLOGÍA En el presente estudio, se lleva a cabo una revisión bibliográfica meticulosa y estructurada sobre la implementación del secuenciamiento completo del genoma de las levaduras Saccharomyces cerevisiae en las industrias cerveceras. La identificación de palabras clave, tales como "Saccharomyces cerevisiae", "Whole Genome Sequencing" y "Ethanol", resultó esencial gracias a la formulación precisa de la pregunta de investigación. Estos términos fueron seleccionados meticulosamente con el objetivo de abordar tanto los aspectos genéticos como funcionales de las levaduras en el contexto de la producción cervecera. Un componente crítico de nuestra metodología ha sido la adaptación de los algoritmos de búsqueda a lo largo del proceso investigativo. Inicialmente, se empleó el algoritmo ("Saccharomyces cerevisiae" [Mesh]) AND ("Whole Genome Sequencing" [Mesh]) AND ("Ethanol" [Mesh]) para explorar bases de datos. A medida que la investigación progresó, se incorporaron términos adicionales a la búsqueda para ampliar el rango de información. El algoritmo resultante incluyó ("Saccharomyces cerevisiae" [Mesh] OR “Yeast strains” [Mesh]) AND ("Whole Genome Sequencing" [Mesh] OR “Genome Sequencing” [Mesh]) AND ("Fermentation" [Mesh] or “Ethanol” [Mesh]). Finalmente, se implementó un algoritmo más completo: ("Saccharomyces cerevisiae" [Mesh] OR “Brewer's yeast” [Mesh] OR “Saccharomyces cerevisiae Strains” [Mesh] OR “Yeast strains” [Mesh]) AND ("Whole Genome Sequencing" [Mesh] OR “Genome Sequencing” [Mesh] OR “DNA Sequence” [Mesh] OR “Genetic Mapping” [Mesh]) AND ("Fermentation" [Mesh] or “Ethanol” [Mesh] OR “Bioalcohol Production” [Mesh]). Durante el proceso de búsqueda, se accedió a diversas plataformas y páginas web, entre 12 ellas ProQuest, PubMed, SciELO y Google Scholar, con el objetivo de recopilar información relevante. Estas plataformas proporcionan acceso a una amplia variedad de revistas científicas, libros y documentos académicos que abordan la aplicación de la técnica de secuenciamiento completo del genoma en levaduras de la especie Saccharomyces cerevisiae durante el proceso de fermentación en la producción de cerveza y bebidas espirituosas Para refinar la búsqueda y garantizar la inclusión de estudios pertinentes, se aplicaron filtros específicos. Inicialmente, se aplicó un filtro para incluir sólo estudios completos y gratuitos. Posteriormente, se procedió a excluir determinados tipos de publicaciones como resúmenes de conferencias o cartas editoriales, priorizando investigaciones con diseños más sólidos. Se establecieron criterios temporales, limitando la búsqueda a publicaciones de los últimos diez años para asegurar la inclusión de investigaciones recientes y relevantes. Además, se aplicaron filtros de idioma, priorizando la inclusión de estudios en inglés y español para garantizar la accesibilidad y comprensión del contenido. Para evitar la redundancia de datos, se procedió a descartar duplicados durante el proceso de selección. Se aplicaron filtros adicionales para incluir únicamente investigaciones centradas en levaduras Saccharomyces cerevisiae utilizadas en la industria cervecera o afines, descartando así estudios no relacionados con el ámbito de interés. 13 3. RESULTADOS La investigación se enfocó en la propuesta del secuenciamiento completo del genoma como un método prometedor para identificar cepas de levaduras Saccharomyces cerevisiae con una capacidad mejorada de producción de etanol. Se realizó un análisis de 11 estudios obtenidos de diversas plataformas como ProQuest, PubMed, SciELO y Google Scholar, con una exclusión mínima de artículos debido a la limitada disponibilidad de información relevante. Estos estudios abarcaron un período desde 2009 hasta 2024 y provinieron de una variedad de ubicaciones geográficas, incluyendo países como Estados Unidos, Australia, China y Grecia, entre otros. El objetivo de la revisión bibliográfica fue proporcionar una visión general del corpus de literatura, centrándose en los genes asociados con la producción de etanol, los métodos utilizados para su identificación y modificación. Además, se revisaron diversos métodos y tecnologías para mejorar la producción de etanol en levaduras. Asimismo, se exploró en detalle el proceso del secuenciamiento completo del genoma, su aplicación y los sectores que lo utilizaban. Este enfoque se orientó específicamente hacia la industria cervecera y sectores afines, como el vino, bioetanol, aguardiente y cachaza, debido a la falta de información disponible. 14 Tabla 1: Cuadro de síntesis de los estudios relevantes a la investigación Título Autor Método Resultados Limitaciones Saccharomyces Reiter T, RNA-seq de series Se identificó un programa El estudio puede tener cerevisiae Gene Montpetit R, temporales, análisis central de expresión génica limitaciones relacionadas con Expression during Byer S, Frias de expresión por S. cerevisiae en el número y diversidad de Fermentation of I, Leon E, diferencial, muestreo fermentaciones de vinos fermentaciones, un tamaño de Pinot Noir Wines Viano R, et al. y análisis de Pinot Noir a escala muestra más grande y diverso at an Industrially fermentación, y industrial, podría ofrecer una Relevant Scale análisis de datos independientemente de la comprensión más completa bioinformáticos, cosecha. de la expresión génica de S. para estudiar la Genes destacados en la cerevisiae. expresión génica fermentación de vino: Los hallazgos pueden ser durante la ADH1 para la conversión específicos de las fermentación del de acetaldehído a etanol y condiciones y variedades de vino Pinot Noir a HXT1/HXT4 para el uva estudiadas. escala industrial. transporte de glucosa. Se reconoce la presencia de microorganismos no Saccharomyces metabólicamente activos 15 Evaluation of Varela C, Ensayo de placas Identificaron genes clave Solo 15 de las 41 cepas Gene Kutyna DR, para el tamizaje de para reducir la producción mutantes construidas Modification Solomon MR, colonias con de etanol en levaduras de mostraron una producción Strategies for the Black CA, actividad de glucosa vino. significativamente menor de Development of Borneman A, oxidasa. La sobreexpresión de los etanol, lo que indica que la Low-Alcohol-Win Henschke PA, Transformaciones de genes GPD1 y GPD2 efectividad de las e Yeasts et al. levaduras mediante (producción de glicerol) modificaciones genéticas el método de acetato mostró ser prometedor para puede ser limitada. de reducir la producción de No se estudió las litio-polietilenglicol. etanol. interacciones entre diferentes PCR del gen GOX y La sobreexpresión de genes modificaciones genéticas o clonación en el de la rama reductiva del sus efectos combinados. plásmido ciclo del ácido Hallazgos limitados al fondo pCV1-FBA1pMFα. tricarboxílico (PYC1, de levadura de vino SPME FUM1, MDH2 y FRD1) y AWRI1631. (microextracción en la deleción de PDC5 No se aplicó secuenciamiento fase sólida). (producción de etanol), genómica a las cepas con Cromatografía de HXK2 y MIG1 (represión menor producción de etanol. gases para la de glucosa) disminuyó la cuantificación de producción y concentración etanol y glicerol. de etanol. Complete genome Costa ACT, Se determinó la Este estudio secuenció y Falta de validación funcional sequence and Hornick J, secuencia completa analizó el genoma de una de las variaciones genéticas y analysis of a Antunes TFS, del genoma de cepa de Saccharomyces su impacto en la producción Saccharomyces Santos AMC, Saccharomyces cerevisiae para la de alcohol, limitando la cerevisiae strain Fernandes cerevisiae utilizando producción de aguardiente comprensión de la cepa. El used for AAR, Broach las plataformas de caña. Se identificaron enfoque en una sola cepa de sugarcane spirit JR, et al. Illumina HiSeq y características únicas, como Saccharomyces cerevisiae production PacBio RS II, con alteraciones en genes de usada en aguardiente puede ensamblaje mediante metabolismo y alta no ser generalizable. La falta SPAdes. La capacidad de fermentación. de detalles sobre condiciones anotación del Los genes clave en el específicas de fermentación y genoma se realizó metabolismo de la falta de abordaje de con AUGUSTUS. carbohidratos incluyen factores epigenéticos Se comparó ADH1, ADH2, ADH3, impactan la interpretación genómicamente con ADH4, ADH5, ADH6, genómica. S288c y otras cepas ADH7, PDC1, PDC5, de cachaça. El PDC6 y PDC7, implicados análisis incluyó en la conversión de enriquecimiento GO, azúcares a etanol durante la evaluación de fermentación, completitud por proporcionando recursos BUSCO y análisis genéticos valiosos para la estadístico en R. mejora de la producción. Improved Hou L. El estudio utilizó la El uso de la reorganización El estudio no demostró las Production of reorganización genómica mejora diferencias genéticas entre la Ethanol by Novel genómica para rápidamente la resistencia nueva cepa S3-10 y la Genome Shuffling aumentar la al estrés y la fermentación control, que causaron el in Saccharomyces producción de etanol en cepas de levadura aumento en factores de estrés cerevisiae y mejorar la industrial. La cepa S3-10 y producción de etanol. Se resistencia al estrés destaca por su mejora en la enfocó solo en mejorar la 16 en Saccharomyces tolerancia al estrés y un producción y resistencia al cerevisiae. Se aplicó 10.96% más de estrés en Saccharomyces cromatografía rendimiento de etanol que cerevisiae, sin explorar otras líquida de alta el control, atribuido a su características relevantes para resolución (HPLC) fase de crecimiento la producción de bioetanol. para medir glucosa, exponencial prolongada y glicerol y etanol, mayor actividad mientras que la metabólica. mutagénesis con etilmetanosulfonato (EMS) indujo variación genética. Se empleó citometría de flujo para medir el contenido de ADN nuclear en levaduras. Proteomics Davydenko S, Se utilizaron Los autores encontraron El estudio tiene limitaciones Answers Which Meledina T, métodos como que la expresión de los al centrarse en solo tres cepas Yeast Genes Are Mittenberg A, electroforesis genes glicoxalasa, HEM2 y de levadura, posiblemente no Specific for Shabelnikov bidimensional y GDB1 aumentó en cepas de representativas de todas las Baking, Brewing, S, Vonsky M, espectrometría de levadura productoras de utilizadas en procesos and Ethanol Morozov A. masas para separar e etanol en comparación con industriales. Además, solo Production identificar proteínas cepas de levadura identificó proteínas con con expresión cervecera. También cambios de expresión sin alterada. Se aplicó el identificaron varios genes explorar los mecanismos índice emPAI para de alcohol deshidrogenasa genéticos subyacentes, clarificar el (ADH1, ADH3, ADH4, efectos ambientales, contenido relativo de ADH5 y SFA1) que modificaciones genéticas o proteínas, y se participan en la conversión interacciones fraccionaron de acetaldehído a etanol proteína-proteína en los péptidos mediante durante la fermentación de niveles de expresión de cromatografía glucosa. proteínas. líquida. La tinción con azul brillante Coomassie G-250 permitió visualizar las proteínas. A Novel Strategy Tao X, Zheng Se emplearon Se crearon cepas de La falta de secuenciación to Construct Yeast D, Liu T, diversos métodos y levadura innovadoras con genómica en la cepa SZ3-1 Saccharomyces Wang P, Zhao tecnologías, mejor rendimiento y limita la identificación de las cerevisiae Strains W, Zhu M, et incluyendo el tolerancia al estrés (SZ3-1) variaciones genéticas for Very High al. análisis de viabilidad mediante reorganización responsables de las mejoras. Gravity celular, evaluación genómica y modificación La aplicabilidad de la Fermentation de la integridad de la génica. Estas cepas estrategia a diferentes membrana durante la demostraron un condiciones o fermentación de rendimiento mejorado en microorganismos no está etanol, fermentación de alta demostrada. determinación de la gravedad, con mayor No se abordan explícitamente estabilidad producción de etanol y aspectos económicos y 17 fermentativa, menos subproductos no ambientales de la estrategia. medición de deseados, así como mayor metabolitos, y tolerancia al estrés y mayor análisis del integridad de la membrana rendimiento y celular durante la supervivencia fermentación de etanol. La celular durante la estabilidad fermentativa de fermentación. los híbridos seleccionados se evidenció en su rendimiento constante y cariotipos consistentes tras múltiples subcultivos. La estrategia desarrollada tiene potencial para la cría industrial de cepas y aplicaciones en otros microorganismos y mejoras de características. Guidance Baert L, El estudio destaca El artículo destaca que la La secuenciación genómica document on the McClure P, métodos y secuenciación genómica completa (WGS) puede use of whole Winkler A, tecnologías para la completa (WGS) es eficaz resultar costosa y no es la genome Karn J, secuenciación para identificar relaciones opción ideal cuando se sequencing Bouwknegt M, genómica completa genéticas en aislamientos buscan resultados rápidos. Se (WGS) for source Klijn A. (WGS) en microbianos, facilitando la necesita experiencia tanto en tracking from a microbiología detección de contaminación operaciones de laboratorio food industry alimentaria. Incluye y la implementación de como en análisis perspective el aislamiento y medidas de control. El uso bioinformático para cultivo de de WGS en la industria interpretar los resultados de microorganismos en alimentaria requiere WGS y traducirlos en la fabricación de recursos y una decisiones prácticas. Además, alimentos o infraestructura dedicada. La compartir datos de WGS productos selección de proveedores presenta limitaciones debido terminados, de servicios de a preocupaciones sobre extracción de ADN, secuenciación para WGS privacidad y derechos de plataformas de implica consideraciones propiedad intelectual. La secuenciación como técnicas como tecnologías validación del flujo de trabajo Illumina y Ion de secuenciación y es esencial para asegurar la Torrent, análisis herramientas/plataformas precisión y confiabilidad de bioinformático bioinformáticas. La los resultados, contribuyendo (verificación de interpretación interna de a la estandarización. calidad, SNP y resultados de WGS por la MLST) y la empresa, basada en interpretación de conocimiento operativo y resultados, metadatos, es crucial para subrayando la decisiones prácticas. importancia de la validación del flujo de trabajo y controles de calidad. Whole genome Otero JM, Se aplicaron Los resultados incluyen la Las limitaciones del estudio sequencing of Vongsangnak diversos métodos y obtención de las secuencias incluyen la cobertura del 18 Saccharomyces W, Asadollahi tecnologías, genómicas de cepas de S. genoma, ya que los modelos cerevisiae: from MA, incluyendo el cerevisiae mediante metabólicos de S. cerevisiae genotype to Olivares-Hern aislamiento de ADN Illumina/Solexa. La abarcan sólo el 13-14% del phenotype for andes R, con cultivos de S. caracterización fisiológica genoma, limitando la improved Maury J, cerevisiae, reveló correlaciones entre comprensión integral de metabolic Farinelli L, et secuenciación del la fisiología y SNPs no relaciones genotipo-fenotipo. engineering al. genoma mediante sinónimos, indicando Aunque se realiza análisis del applications Illumina/Solexa, utilidad para la ingeniería transcriptoma, este solo fermentaciones y metabólica. El análisis del puede ofrecer una visión caracterización transcriptoma mostró parcial de los mecanismos fisiológica, análisis diferencias significativas en regulatorios complejos. La del transcriptoma la expresión génica, identificación de SNPs, con microarrays especialmente en genes aunque detallada, no aborda Affymetrix, y relacionados con el explícitamente las evaluación de la metabolismo del carbono. limitaciones de los métodos. integridad del ARN El estudio sienta las bases Además, los hallazgos son utilizando el para análisis comparativos específicos de ciertas cepas, Bioanalizador de ingeniería metabólica limitando su generalización a Agilent 2100 y kit SNP, contribuyendo al otras levaduras u organismos. RNA 6000 Nano diseño de fábricas celulares LabChip. Se empleó mejoradas. el kit FastRNA Pro RED para la extracción total de ARN. Genome Nakao Y, Se emplearon varios El genoma de la levadura El ensamblaje del genoma de Sequence of the Kanamori T, métodos, como la de elaboración lager se la levadura de elaboración Lager Brewing Itoh T, secuenciación de ensambló en 3184 contigs y lager podría contener brechas Yeast, an Kodama Y, genoma completo y 796 supercontigs con Phred y errores, afectando la Interspecies Rainieri S, bibliotecas y PCAP, revelando una precisión del análisis. La Hybrid Nakamura N, cosmídicas, para secuencia consensuada identificación de rearreglos et al. analizar el genoma preliminar de 23.4 Mb. Se cromosómicos se basó en de la levadura de identificó como un híbrido PCR y secuenciación, con elaboración lager. de S. cerevisiae y S. limitaciones para detectar Las secuencias se bayanus, con estructuras variaciones complejas. ensamblaron con cromosómicas y regiones El estudio se enfocó en Phred y PCAP, y se subteloméricas distintas. Se aspectos genéticos y realizaron análisis confirmaron rearranglos cromosómicos, sin explorar filogenéticos, cromosómicos y completamente la conexión identificación de translocaciones mediante directa entre los hallazgos rearreglos PCR y mapeo óptico con genómicos y las cromosómicos y XhoI, proporcionando características específicas de mapeo óptico. El información detallada sobre elaboración de la levadura, proyecto completo su genoma. sugiriendo la necesidad de se depositó en investigaciones adicionales DDBJ/EMBL/GenB para comprender mejor las ank bajo el número implicaciones funcionales. de acceso ABPO00000000. Ethanol yield Yang P, Jiang Se utilizaron La eliminación de los genes El estudio se enfocó en improvement in S, Lu S, Jiang diversas técnicas, GPD2, FPS1, ADH2 y eliminar cuatro genes en S. 19 Saccharomyces S, Jiang S, como la edición DLD3 en S. cerevisiae cerevisiae, sin explorar otras cerevisiae GPD2 Deng Y, et al. genética mediante CRISPR-Cas9 modificaciones genéticas que Delta FPS1 Delta CRISPR-Cas9 en S. generó la cepa modificada podrían mejorar aún más el ADH2 Delta cerevisiae, HPLC y SCGFAD, con un aumento rendimiento del etanol. DLD3 Delta GC-MS para medir del 18.58% en contenido de Realizado en laboratorio, no mutant and la producción de etanol y reducción de se sabe cómo la cepa molecular etanol, modelado de subproductos. El análisis modificada se desempeñaría mechanism flujo metabólico, y metabólico y a nivel industrial. No evaluó exploration based análisis de transcriptómico reveló un el impacto en parámetros on the metabolic transcriptoma aumento en el flujo de como pH, temperatura o fux and mediante carbono hacia el etanol y la disponibilidad de oxígeno. transcriptomics secuenciación identificación de 472 genes No incluyó un análisis approaches Illumina Hiseq. Se diferencialmente económico detallado ni emplearon expresados, sugiriendo que investigó el impacto en el herramientas como esta cepa podría mejorar la sabor del etanol producido. CASAVA, producción de etanol y la Trimmoatic, viabilidad económica en la HISAT2, RSeQC, industria del bioetanol. DEGseq, GO y KEGG para analizar datos y funciones génicas, y se usó Matlab para cálculos y análisis de datos. Omics Lu Z, Guo L, Utilizaron diversas La cepa mutante (MT) de El estudio se enfoca en la Sequencing of Chen X, Lu Q, técnicas, como Saccharomyces cerevisiae caracterización genética y Saccharomyces Wu Y, Chen conteo automático mostró ventajas metabólica de la cepa cerevisiae Strain D, et al. de células, significativas en mejorada de Saccharomyces with Improved cromatografía de crecimiento y fermentación cerevisiae para producción de Capacity for gases y RNA-Seq, de etanol (16.13% v/v) en etanol, sin abordar Ethanol para analizar la comparación con la cepa ampliamente la escalabilidad Production fermentación en S. salvaje (WT, 13.72% v/v) industrial. Carece de análisis cerevisiae. También en medio con 30% de económico detallado y no realizaron extracción sacarosa. El análisis discute desafíos a largo plazo de ADN completo, genómico y de expresión y consideraciones con secuenciación reveló cambios en vías regulatorias en la aplicación Illumina NovaSeq metabólicas clave, industrial de la cepa 6000, y emplearon identificando genes modificada. herramientas como cruciales para la Burrows-Wheeler adaptabilidad metabólica Aligner y GATK en la cepa MT durante la Unified Genotyper fermentación. Los datos de para análisis de WGS y RNA-Seq están datos genómicos. La disponibles en el NCBI precisión de SRA bajo PRJNA885247. RNA-Seq fue confirmada mediante qRT-PCR. 20 El análisis detallado de los estudios reveló una variedad de genes relacionados con la producción de etanol en cepas de levaduras Saccharomyces cerevisiae. Entre los hallazgos más destacados se encuentran genes como ADH1, ADH2, ADH3, ADH4, ADH5, ADH6, ADH7, HXT1, HXT4, PDC1, PDC5, PDC6 y PDC7 (2, 3, 5, 6, 7), que están implicados en la conversión de azúcares a etanol durante la fermentación. Estos genes fueron identificados en varios estudios, como: "Evaluation of Gene Modification Strategies for the Development of Low-Alcohol-Wine Yeasts" y "Genome Sequencing and Comparative Analysis of Saccharomyces cerevisiae Strains of the Peterhof Genetic Collection". La sobreexpresión de genes como GPD1 y GPD2, que participan en la síntesis de glicerol, ha demostrado ser una estrategia prometedora para disminuir la producción de etanol (5); sin embargo, utilizada de manera inversa, puede aumentar la producción de este último. En cuanto a los métodos y tecnologías utilizados para identificar y/o alterar genes, se encontraron diversos enfoques, como el uso de técnicas de mutagénesis dirigida mediante PCR o EMS (8, 9), edición genética mediante CRISPR-Cas9 (7), y análisis de expresión génica mediante RNA-seq (2, 19). A pesar de algunas variaciones en los enfoques utilizados, se observó un acuerdo general en la eficacia de estos métodos para mejorar la producción de etanol en cepas de Saccharomyces cerevisiae. Finalmente, se destaca un conjunto de estudios que han identificado y desarrollado cepas de Saccharomyces cerevisiae con una notable mejora en la producción de etanol. Entre estos estudios resaltan los trabajos de Hou L (9), donde se empleó la reorganización genómica para mejorar la producción de etanol y la resistencia al estrés en las cepas de levadura industrial, lo cual resultó en la creación de la cepa S3-10. Otro estudio relevante fue llevado a cabo por Tao X et al (10), quienes también usaron la técnica de reorganización genómica y la modificación genética, culminando en la 21 creación de la cepa SZ3-1. Ambas cepas exhibieron mejoras significativas en la producción de etanol y tolerancia al estrés. Además, las investigaciones de Nakao Y et al (18) y Lu Z et al (19) resaltan la relevancia del secuenciamiento completo del genoma como la técnica más eficaz para identificar y desarrollar estas cepas mejoradas. Nakao Y et al (18) exploraron el genoma de cepas de levadura de elaboración lager, mientras que Lu Z et al (19) analizaron cepas de Saccharomyces cerevisiae con una mayor capacidad de producción de etanol. En conjunto, estas investigaciones resaltan la importancia de esta técnica avanzada en el desarrollo de cepas mejoradas de levadura para aplicaciones industriales. 22 4. DISCUSIÓN La revisión bibliográfica destaca varias limitaciones que podrían dificultar la aplicación práctica del secuenciamiento completo del genoma para optimizar la producción de etanol en la industria cervecera. Una de estas limitaciones se relaciona con la escalabilidad de las estrategias propuestas, ya que la mayoría de los estudios se basan en condiciones de laboratorio o a pequeña escala, lo que podría no reflejar adecuadamente las condiciones reales de producción industrial (19). Esta falta de escalabilidad plantea dudas sobre la efectividad de las cepas de levaduras modificadas genéticamente en entornos industriales. Además, se observa una falta de especificidad en los hallazgos para las condiciones experimentales utilizadas y una escasa generalización a otras cepas de levaduras, lo que subraya la necesidad de una mayor diversidad de estudios que abordan una gama más amplia de condiciones y cepas de levaduras para garantizar la validez y aplicabilidad de los resultados (2, 17). Otro aspecto crítico es la falta de validación funcional de las variaciones genéticas identificadas y su impacto en la producción de etanol. Aunque el secuenciamiento completo del genoma puede proporcionar información detallada sobre las características genéticas de las cepas de levaduras, es esencial realizar estudios adicionales para comprender cómo estas variaciones afectan realmente la producción de etanol (5, 6). También, la revisión bibliográfica resalta la importancia de considerar otros factores externos que pueden influir en la producción de etanol, como la composición del sustrato utilizado para la fermentación y la presencia de contaminantes microbianos. Estos factores pueden tener un impacto significativo en la eficiencia y la velocidad de la fermentación alcohólica, lo que destaca la necesidad de abordar una gama más amplia de variables en los estudios de optimización de la producción de etanol. En cuanto a la implementación del secuenciamiento completo del genoma, se señala que 23 una de las limitaciones radica en la necesidad de todo el material genético, ya que los genes relevantes para la fermentación están dispersos en diversas regiones genéticas y cromosómicas (4). Sin embargo, se han llevado a cabo investigaciones para identificar regiones genéticas o genes específicos relacionados con la producción de etanol o fermentación, lo que demuestra que esta técnica puede ser útil tanto para evaluar características a nivel del material genético completo como en regiones específicas en cada cepa de levadura. Por último, en relación con la técnica de secuenciación completa, los estudios destacan su importancia en industrias similares, como la de alimentos, aunque también señalan la necesidad de personal capacitado para interpretar y traducir los resultados en acciones prácticas, así como la importancia de la capacitación continua del personal involucrado (15). Respecto a los costos, una mayor investigación ayudo a refutar las preocupaciones iniciales, ya que el costo de tercerizar las muestras para su secuenciación oscila alrededor de 90 a 120 dólares por muestra (20). 24 5. CONCLUSIONES Basándonos en los objetivos establecidos y los resultados obtenidos, podemos concluir lo siguiente: En primer lugar, hemos logrado identificar un limitado número de investigaciones que emplean el secuenciamiento genético en cepas de levaduras Saccharomyces cerevisiae con el fin de identificar cepas con mejor producción de etanol. A través de una exhaustiva búsqueda en diversas plataformas académicas, hemos recopilado datos de 11 estudios relevantes que abarcan un período de tiempo significativo y provienen de distintas ubicaciones geográficas, lo que ha proporcionado una visión global del estado actual de la investigación en este campo. En segundo lugar, el análisis detallado de estos estudios reveló una serie de genes asociados con la producción de etanol en cepas de levaduras Saccharomyces cerevisiae, como como ADH1, ADH2, PDC1, y HXT1. Además, se destacaron los métodos CRISPR-Cas9 y “Genome Shuffling” como tecnologías efectivas para modificar e identificar estos genes, así como el desarrollo de cepas mejoradas con una notable mejora en la producción de etanol y tolerancia al estrés como las cepas S3-10, SZ3-1, ABPO00000000 y PRJNA885247 . Finalmente, los resultados resaltan la importancia del secuenciamiento completo del genoma como una técnica prometedora y eficaz para identificar y, a futuro, desarrollar cepas mejoradas de levadura para aplicaciones industriales en la producción de etanol. Esta técnica avanzada permite una comprensión más profunda de los genes y procesos involucrados en la fermentación, lo que facilita la ingeniería genética dirigida a optimizar la producción de etanol para la industria cervecera. 25 6. RECOMENDACIONES En lo que respecta a las recomendaciones para mejorar este estudio, se sugiere iniciar con la adquisición de las levaduras necesarias. Esto puede lograrse a través de la colaboración con empresas de la industria cervecera, la compra independiente o la recolección de cepas autóctonas del Perú. Posteriormente, se recomienda tercerizar el proceso de secuenciamiento. Esta medida evitará la necesidad de adquirir equipos, materiales o personal capacitado para realizar el secuenciamiento y, con la información resultante, será posible identificar las secuencias genéticas relevantes para la producción de etanol. De forma paralela, se recomienda verificar la producción de etanol en cada cepa secuenciada. A partir de este punto, será esencial contar con la infraestructura adecuada de un laboratorio. Esto se debe a que gracias a la información obtenida en los pasos anteriores, se podrá proceder a la creación de nuevas cepas de Saccharomyces cerevisiae con mejoras en su capacidad de producción de etanol, utilizando diversas técnicas disponibles. Estas acciones combinadas servirán para optimizar el estudio y fomentar avances significativos en la producción de etanol, contribuyendo así al desarrollo y la eficiencia del proceso fermentativo en la industria cervecera. 26 7. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1. Walker GM, Stewart GG. Saccharomyces cerevisiae in the production of fermented beverages. Beverages. 2016;2(4):1–12. 2. Reiter T, Montpetit R, Byer S, Frias I, Leon E, Viano R, et al. Saccharomyces Cerevisiae Gene Expression During Fermentation of Pinot Noir Wines at an Industrially Relevant Scale. Appl Environ Microbiol. 2021;87(11):1–21. 3. Davydenko S, Meledina T, Mittenberg A, Shabelnikov S, Vonsky M, Morozov A. Proteomics answers which yeast genes are specific for baking, brewing, and ethanol production. Bioengineering. 2020;7(4):1–15. 4. Deed RC, Fedrizzi B, Gardner RC. Saccharomyces Cerevisiae FLO1 gene demonstrates genetic linkage to increased fermentation rate at low temperatures. G3 Genes, Genomes, Genet. 2017;7(3):1039–48. 5. Varela C, Kutyna DR, Solomon MR, Black CA, Borneman A, Henschke PA, et al. Evaluation of gene modification strategies for the development of low-alcohol-wine Yeasts. Appl Environ Microbiol. 2012;78(17):6068– 77. 6. Costa ACT, Hornick J, Antunes TFS, Santos AMC, Fernandes AAR, Broach JR, et al. Complete genome sequence and analysis of a Saccharomyces cerevisiae strain used for sugarcane spirit production. Brazilian J Microbiol. 2021;52(3):1087–95. 7. Yang P, Jiang S, Lu S, Jiang S, Jiang S, Deng Y, et al. Ethanol yield improvement in Saccharomyces cerevisiae GPD2 Delta FPS1 Delta 27 ADH2 Delta DLD3 Delta mutant and molecular mechanism exploration based on the metabolic flux and transcriptomics approaches. Microb Cell Fact [Internet]. 2022;21(1):1–14. Available from: https://doi.org/10.1186/s12934-022-01885-3 8. Papadimitriou K, Kapolos J, Koliadima A. Fermentation Efficiency of Genetically Modified Yeasts in Grapes Must. 2022; 11, 413. https://doi.org/10.3390/foods11030413 9. Hou L. Improved production of ethanol by novel genome shuffling in Saccharomyces cerevisiae. Appl Biochem Biotechnol. 2010;160(4):1084– 93. 10. Tao X, Zheng D, Liu T, Wang P, Zhao W, Zhu M, et al. A novel strategy to construct yeast Saccharomyces cerevisiae strains for very high gravity fermentation. PLoS One. 2012;7(2). 11. Barth R. High gravity brewing – the pros and cons - New Food Magazine [Internet]. [cited 2024 Feb 29]. Available from: https://www.newfoodmagazine.com/article/1550/high-gravity-brewing-th e-pros-and-cons/ 12. What is high-gravity brewing? - Micet Craft [Internet]. [cited 2024 Feb 29]. Available from: https://www.micetcraft.com/high-gravity-brewing/ 13. Villa K. high gravity brewing | Craft Beer & Brewing [Internet]. [cited 2024 Feb 29]. Available from: https://beerandbrewing.com/dictionary/4xtnZ4PwZ3/ https://doi.org/10.3390/foods11030413 http://www.newfoodmagazine.com/article/1550/high-gravity-brewing-th http://www.micetcraft.com/high-gravity-brewing/ 28 14. Wolfe A. High Gravity Beer: Big Risk, Bigger Reward - CraftBeer.com [Internet]. [cited 2024 Feb 29]. Available from: https://www.craftbeer.com/craft-beer-muses/high-gravity-beer-big-risk-bi gger-reward 15. Baert L, McClure P, Winkler A, Karn J, Bouwknegt M, Klijn A. Guidance document on the use of whole genome sequencing (WGS) for source tracking from a food industry perspective. Food Control [Internet]. 2021;130:108148. Available from: https://doi.org/10.1016/j.foodcont.2021.108148 16. Kwong JC, Mccallum N, Sintchenko V, Howden BP. Whole genome sequencing in clinical and public health microbiology. Pathology. 2015;47(3):199–210. 17. Otero JM, Vongsangnak W, Asadollahi MA, Olivares-Hernandes R, Maury J, Farinelli L, et al. Whole genome sequencing of Saccharomyces cerevisiae: From genotype to phenotype for improved metabolic engineering applications. BMC Genomics [Internet]. 2010;11(1):723. Available from: http://www.biomedcentral.com/1471-2164/11/723 18. Nakao Y, Kanamori T, Itoh T, Kodama Y, Rainieri S, Nakamura N, et al. Genome sequence of the lager brewing yeast, an interspecies hybrid. DNA Res. 2009;16(2):115–29. 19. Lu Z, Guo L, Chen X, Lu Q, Wu Y, Chen D, et al. Omics Sequencing of Saccharomyces cerevisiae Strain with Improved Capacity for Ethanol Production. Fermentation. 2023;9(5). http://www.craftbeer.com/craft-beer-muses/high-gravity-beer-big-risk-bi https://doi.org/10.1016/j.foodcont.2021.108148 http://www.biomedcentral.com/1471-2164/11/723 29 20. Whole Genome Sequencing - Novogene [Internet]. [cited 2024 Feb 29]. Available from: https://www.novogene.com/us-en/services/research-services/genome-seq uencing/whole-genome-sequencing/ https://www.novogene.com/us-en/services/research-services/genome-sequencing/whole-genome-sequencing/ https://www.novogene.com/us-en/services/research-services/genome-sequencing/whole-genome-sequencing/