SEROLOGÍA PARA LA DETECCIÓN DE INFECCIÓN VIABLE EN PACIENTES CON NEUROCISTICERCOSIS QUE EXPRESAN ANTICUERPOS CONTRA GP50, GP42-39, GP24 EN LLGP-EITB (PATRÓN DE ANTICUERPOS CLASE II) TESIS PARA OPTAR EL GRADO DE DOCTOR EN CIENCIAS EN INVESTIGACIÓN EPIDEMIOLÓGICA ANDREA MERCEDES RIVERA SANTILLAN LIMA – PERÚ 2024 ASESOR PhD. HECTOR HUGO GARCIA LESCANO Centro De Salud Global Universidad Peruana Cayetano Heredia CO ASESOR PhD. JAVIER ARTURO BUSTOS PALOMINO Centro De Salud Global Universidad Peruana Cayetano Heredia JURADO DE TESIS DR. MEDDLY LESLYE SANTOLALLA ROBLES PRESIDENTE DRA. YENY ODALY TINOCO FIGUEROA VOCAL DRA. LUZ MARIA MOYANO VIDAL SECRETARIA DEDICATORIA A mis padres Enedina y Genaro, por su amor incondicional y sus sabias palabras que me motivaron siempre a seguir adelante. A Jorge, mi compañero de vida por apoyarme en cumplir mis metas y caminar uno al lado del otro, y a Gabriel, Leonardo y Alonso por ser quienes ponen de cabeza mi mundo y mi corazón. AGRADECIMIENTOS A los Dres. Héctor H. García, Javier A. Bustos y Andrés G. Lescano por su apoyo y mentoría durante el desarrollo del doctorado. Al personal de la Unidad de Cisticercosis del INCN y del Laboratorio de neurocisticercosis de la UPCH, especialmente a Luz Toribio, Kathia Linares y Yesenia Castillo. Y a todos mis amigos quienes siempre me han alentado a ser persistente. FUENTES DE FINANCIAMIENTO La presente tesis ha sido financiada por el Consejo Nacional de Ciencia, Tecnología e Innovación Tecnológica (FONDECYT/CIENCIA ACTIVA, número de beca: EF033-235-2015). DECLARACIÓN DE AUTOR FECHA 23 AGOSTO 2024 APELLIDOS Y NOMBRES DEL EGRESADO RIVERA SANTILLAN ANDREA MERCEDES PROGRAMA DE POSGRADO DOCTORADO EN CIENCIAS EN INVESTIGACIÓN EPIDEMIOLÓGICA AÑO DE INICIO DE LOS ESTUDIOS 2019 TITULO DEL TRABAJO DE INVESTIGACIÓN DE GRADO SEROLOGÍA PARA LA DETECCIÓN DE INFECCIÓN VIABLE EN PACIENTES CON NEUROCISTICERCOSIS QUE EXPRESAN ANTICUERPOS CONTRA GP50, GP42-39, GP24 EN LLGP-EITB (PATRÓN DE ANTICUERPOS CLASE II) MODALIDAD (marcar) Tesis x Sustentación temática Declaración del Autor La presente Tesis es un Trabajo de Investigación de Grado original y no es el resultado de un trabajo en colaboración con otros, excepto cuando así está citado explícitamente en el texto. Esta tesis representa además una contribución a la comunidad científica y a la sociedad. No ha sido ni enviado ni sometido a evaluación para la obtención de otro grado o diploma que no sea el presente. Teléfono de contacto (fijo / móvil) 992191974 E-mail andrea.rivera.s@upch.pe __________________ Firma del Egresado DNI 43068054 ÍNDICE RESUMEN ABSTRACT I. INTRODUCCIÓN ...................................................................................... 1 II. HIPOTESIS GENERAL ........................................................................... 34 III. JUSTIFICACIÓN ..................................................................................... 35 IV. INVESTIGACIÓN 1: PERFIL DE ANTICUERPOS EN LLGP-EITB Y VARIABLES DEMOGRÁFICAS PARA EL DIAGNÓSTICO DE INFECCIÓN VIABLE EN NEUROCISTICERCOSIS PARENQUIMAL EN PACIENTES CON UN PATRÓN DE ANTICUERPOS CLASE 2 .................... 37 4.1 Resumen .......................................................................................................... 37 4.2 Introducción .................................................................................................... 41 4.3 Materiales y métodos ...................................................................................... 46 4.4 Resultados ....................................................................................................... 53 4.5 Discusión ......................................................................................................... 71 V. INVESTIGACIÓN II: EVALUACIÓN DE LA CAPACIDAD DEL PERFIL CUANTITATIVO DE ANTICUERPOS CONTRA GLICOPROTEÍNAS RECOMBINANTES/SINTÉTICAS DE TAENIA SOLIUM PARA EL DIAGNÓSTICO DE INFECCIÓN VIABLE EN NEUROCISTICERCOSIS PARENQUIMAL Y EXTRAPARENQUIMAL EN PACIENTES CON UN PATRÓN DE ANTICUERPOS CLASE 2 .................... 79 5.1 Resumen .......................................................................................................... 79 5.2 Introducción .................................................................................................... 81 5.3 Materiales y métodos ...................................................................................... 86 5.4 Resultados ....................................................................................................... 92 5.5 Discusión ....................................................................................................... 100 VI. DISCUSIÓN INTEGRADA ................................................................... 110 VII. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES ...................................... 116 VIII. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS .................................................... 118 ANEXOS LISTA DE TABLAS Tabla 1. Comparación de distribución de características de la población 55 Tabla 2. Número de quistes viables 56 Tabla 3. Características de los pacientes evaluados por MBA 57 Tabla 4. Análisis bivariado 58 Tabla 5. Asociación entre la distribución/número de bandas y la viabilidad del parásito (neuroimagen) en pacientes con neurocisticercosis con un patrón clase 2 en WB (n=944) 60 Tabla 6. Características del ensayo de detección de anticuerpos contra glicoproteínas recombinantes/ sintéticas de Taenia solium mediante MBA 65 Tabla 7. Perfil de anticuerpos contra glicoproteínas recombinantes/ sintéticas de Taenia solium según la viabilidad del cisticerco 67 Tabla 8. Modelos evaluados para establecer el número de clases en el análisis de ACL 71 Tabla 9. Resultados de las probabilidades predichas para cada clase 71 Tabla 10. Número y tipo de sueros analizados 92 Tabla 11. Características de los sueros analizados 93 Tabla 12. Mediana del ratio de anticuerpos según tipo de infección 93 Tabla 13. Características de la prueba de detección de anticuerpos contra glicoproteínas recombinantes/sintéticas de Taenia solium (MBA) para detectar infección viable (parenquimal) 98 Tabla 14. Desempeño de la prueba de detección de anticuerpos contra glicoproteínas recombinantes/sintéticas de Taenia solium (MBA) para detectar infección viable (extraparenquimal) 98 Tabla 15. Asociación entre la detección de anticuerpos contra 3 glicoproteínas recombinantes/sintéticas e infección viable parenquimal 99 Tabla 16. Asociación entre la detección de anticuerpos contra 3 glicoproteínas recombinantes/sintéticas e infección viable extraparenquimal 100 LISTA DE FIGURAS Figura 1. Ciclo biológico de Taenia solium: Cisticercosis / Neurocisticercosis 3 Figura 2. NCC parenquimal (A) y NCC extraparenquimal (B) observadas mediante RM sin contraste 9 Figura 3. NCC calcificada observada (dos lesiones que se observan con círculos blancos) mediante TAC sin contraste 9 Figura 4. Cisticerco de Taenia solium 14 Figura 5. Estructura del cisticerco de Taenia solium 15 Figura 6. Hallazgos de neuroimágenes en NCC 22 Figura 7. Hallazgos de neuroimágenes en NCC 23 Figura 8. Bandas de glicoproteínas utilizadas en LLGP-EITB y la familia de glicoproteína a la que pertenece cada una. LLGP-EITB: lentil lectin-bound glycoproteins/enzime-linked immunoelectrotransfer blot 46 Figura 9. Gráfico de área bajo la curva (AUC) de cada antígeno en el total de pacientes evaluados por MBA (n=94) 63 Figura 10. Gráfico de área bajo la curva (AUC) de cada antígeno en subgrupo 1 evaluados por MBA (n=28) 64 Figura 11. Gráfico de área bajo la curva (AUC) de cada antígeno en subgrupo 2 evaluados por MBA (n=33) 64 Figura 12. Gráfico de área bajo la curva (AUC) de cada antígeno en subgrupo 3 evaluados por MBA (n=33) 65 Figura 13. Gráfico de las probabilidades de tener un resultado positivo para cada una de las glicoproteínas evaluadas según cada clase. 73 Figura 14. Gráfico de distribución del ratio de anticuerpos contra la glicoproteína rGP50, según el tipo de infección 95 Figura 15. Gráfico de distribución de ratio de anticuerpos contra la glicoproteína rT24H, según el tipo de infección 95 Figura 16. Gráfico de distribución del ratio de anticuerpos contra la glicoproteína STs18, según el tipo de infección 96 Figura 17. Gráfico de área bajo la curva (AUC) para detectar infección viable parenquimal de cada antígeno, evaluados por MBA. 97 Figura 18. Gráfico de área bajo la curva (AUC) para detectar infección viable extraparenquimal de cada antígeno, evaluados por MBA 98 RESUMEN Introducción: La neurocisticercosis (NCC) es una infección parasitaria del sistema nervioso central responsable del aproximadamente el 30 % de casos de epilepsia en el mundo. El diagnóstico se basa en las neuroimágenes, que requieren equipos sofisticados y de alto costo, poco disponibles en zonas endémicas. Las pruebas serológicas complementan el diagnóstico, más aún cuando la neuroimagen no es concluyente; no obstante, se requieren más herramientas para discernir entre infección viable y no viable, sobre todo para un grupo importante de pacientes, con un patrón serológico clase 2 (GP50, GP42-39 y/o GP24 positivas en LLGP-EITB). Estos pacientes representan casi un tercio de los pacientes con NCC, cuyo diagnóstico de infección viable es complejo. Por tal motivo el presente trabajo de investigación propone, en pacientes con un patrón serológico clase 2: i) evaluar si la distribución de las bandas positivas en LLGP-EITB (2 o 3 bandas) y las características demográficas permiten discriminar infección viable; asimismo, explorar los niveles de anticuerpos contra glicoproteínas recombinantes/sintéticas según la distribución de bandas y ii) evaluar el perfil cuantitativo de anticuerpos contra glicoproteínas (rGP50, rT24H y sTs18) para discriminar infección viable. Investigación 1: Se evaluaron a 944 pacientes con NCC parenquimal. Los individuos con tres bandas positivas tienen 61 % más probabilidad de presentar quistes viables que aquellos con solo dos. Los pacientes del sexo masculino y de 40 años o menos tuvieron 62 % y 35 % más probabilidad de quistes viables. La exploración cuantitativa de anticuerpos contra rGP50, rT24H, sTs14 y sTs18 determinó como punto de corte del multiplex bead-based assay (MBA) ratio: 5.473, 14.16, 7.333 y 3.485, respectivamente (n=94). El tener un resultado positivo a rT24H y sTs18 se asoció a 2.81 y 2.64 veces más posibilidad de presentar quistes viables. La evaluación de anticuerpos contra sTs14, no permitió ver diferencias a nivel de subgrupos (dos o tres bandas positivas en LLGP-EITB). Se observó que las personas que tienden a expresar anticuerpos contra casi todas las glicoproteínas evaluadas tienen 5.4 veces mayor probabilidad de tener cisticercos viables. La medición de anticuerpos contra rGP50 no permitió ver diferencias respecto a la viabilidad. Investigación 2: El estudio incluyó a 160 pacientes con NCC (64 parenquimal, 64 calcificada y 32 extraparenquimal). Las medianas del MBA-ratio de anticuerpos contra rT24H (7.1 vs 1.9) y sTs18 (4.5 vs 1.4) fueron mayores para aquellos con infección viable parenquimal (p<0.001) o extraparenquimal (p<0.001) en comparación con la infección calcificada. No se observaron diferencias en la cuantificación de anticuerpos contra rGP50 entre infección viable y no viable. Los puntos de corte del MBA-ratio de anticuerpos contra rGP50, rT24H y sTs18 para determinar positivo o negativo el resultado fueron: 12.1; 3.438 y 2.307, para infección parenquimal, y de 7.79; 2.202 y 2.084, para infección extraparenquimal, respectivamente. La sensibilidad y especificadas de la prueba para detectar infección viable usando rGP50, rT24H y sTs18 fueron 60.9 y 59.4; 75.0 y 64.1; 79.7 y 65.6, en infección parenquimal; y de 71.9 y 53.1; 81.3 y 56.3; 81.0 y 62.5, en infección extraparenquimal, respectivamente. Los pacientes con infección parenquimal y un resultado positivo a rT24H y sTs18 tienen 5.28 y 7.26 veces más la posibilidad de tener infección viable; los pacientes con infección extraparenquimal y resultado positivo a sT24H y sTs18 tienen 5.6 y 7.2 veces más la posibilidad de tener infección viable. No hubo relación entre un resultado positivo a rGP50 e infección viable. Se concluye que la distribución de bandas, el sexo y la edad permitirían ayudar a discriminar entre infección viable en pacientes con un patrón clase 2 en LLGP- EITB. Asimismo, la cuantificación de anticuerpos contra rT24H y sTs18 brindan información serológica que apoyaría el diagnóstico complementando el diagnostico para identificar pacientes con infección viable. Esto es relevante ya estos resultados permitiría tener más herramientas diagnosticas fácilmente implementables en establecimiento detección desde el nivel primario y permitirían priorizar el tamizaje imagenológico de NCC viable en zonas de escaso acceso a neuroimágenes. PALABRAS CLAVE: Anticuerpos, glicoproteínas, Taenia solium, infección viable, neurocisticercosis ABSTRACT Introduction: Introduction: Neurocysticercosis (NCC) is a parasitic infection of the central nervous system responsible for approximately 30% of epilepsy cases worldwide. The diagnosis is based on neuroimaging, which requires preferred and high-cost equipment, which is rarely available in endemic areas. Serological tests complement the diagnosis, even more so when neuroimaging is not conclusive; However, more tools are required to discern between viable and non-viable infections, especially for an important group of patients, with a class 2 serological pattern (GP50, GP42-39 and/or GP24 positive in LLGP-EITB). These patients represent almost a third of patients with NCC, whose diagnosis of viable infection is complex. For this reason, this research proposes, in patients with a class 2 serological pattern: i) evaluate whether the distribution of positive bands in LLGP- EITB (2 or 3 bands) and demographic characteristics allow discriminating viable infection; in addition, explore the levels of antibodies against recombinant/synthetic glycoproteins according to the distribution of bands, and ii) evaluate the quantitative profile of antibodies against glycoproteins (rGP50, rT24H and sTs18) to discriminate viable infection. Investigation 1: 944 patients with parenchymal NCC were evaluated. Individuals with three positive bands are 61% more likely to have viable cysts than those with only two. Male patients aged 40 years or younger were 62% and 35% more likely to have viable cysts. The quantitative exploration of antibodies against rGP50, rT24H, sTs14 and sTs18 determined the cut-off point of the multiplex bead-based assay (MBA) ratio: 5.473, 14.16, 7.333 and 3.485, respectively (n=94). Having a positive result for rT24H and sTs18 was associated with a 2.81 and 2.64-times greater chance of presenting viable cysts. The evaluation of antibodies against sTs14 did not allow us to see differences at the subgroup level (two or three positive bands in LLGP-EITB). It was observed that people who tend to express antibodies against almost all glycoproteins evaluated are 5.4 times more likely to have viable cysticerci. The measurement of antibodies against rGP50 did not reveal differences regarding viability. Investigation 2: The study included 160 patients with NCC (64 parenchymal, 64 calcified, and 32 extraparenchymal). The median MBA-ratio of antibodies against rT24H (7.1 vs 1.9) and sTs18 (4.5 vs 1.4) were higher for those with viable parenchymal (p<0.001) or extraparenchymal (p<0.001) infection compared to calcified infection. No differences were observed in the quantification of antibodies against rGP50 between viable and non-viable infection. The cut-off points of the MBA-ratio of antibodies against rGP50, rT24H and sTs18 to determine positive or negative results were: 12.1; 3,438 and 2,307, for parenchymal infection, and 7.79; 2,202 and 2,084, for extraparenchymal infection, respectively. The sensitivity and specifications of the test to detect viable infection using rGP50, rT24H and sTs18 were 60.9 and 59.4; 75.0 and 64.1; 79.7 and 65.6, in parenchymal infection; and 71.9 and 53.1; 81.3 and 56.3; 81.0 and 62.5, in extraparenchymal infection, respectively. Patients with parenchymal infection and a positive result for rT24H and sTs18 have a 5.28 and 7.26-times greater chance of having viable infection; Patients with extraparenchymal infection and a positive result for sT24H and sTs18 have a 5.6 and 7.2-times greater chance of having viable infection. There was no relationship between a positive rGP50 result and viable infection. It is concluded that the distribution of bands, sex and age would help discriminate between viable infection in patients with a class 2 pattern in LLGP-EITB. Likewise, the quantification of antibodies against rT24H and sTs18 provides serological information that would support the diagnosis, complementing the diagnosis to identify patients with viable infection. This is relevant since these results would allow for more easily implementable diagnostic tools in detection establishments from the primary level and would allow prioritizing imaging screening for viable NCC in areas with little access to neuroimaging. KEYWORDS: Antibodies, glycoproteins, Taenia solium, viable infection, neurocysticercosis 1 I. INTRODUCCIÓN 1.1. Generalidades Taenia solium es un parásito céstodo que posee un ciclo biológico complejo e involucra a dos hospedadores: cerdos y humanos. El ser humano, quien es el único hospedero definitivo, alberga en el intestino delgado a la forma adulta del parásito; esta infección se conoce como teniasis y convierte al ser humano en el reservorio y diseminador más importante del parásito al liberar huevos de Taenia solium a través de las heces (1). Los cerdos, quienes actúan como hospederos intermediarios, portan los estados larvarios o quistes (cisticercosis porcina). Los cerdos se infectan después de consumir heces contaminadas con los huevos (procedentes de humanos con teniasis) y comúnmente desarrollan quistes a nivel de los músculos o el tejido subcutáneo (2). Los seres humanos también pueden actuar como hospederos intermediarios accidentales y desarrollar cisticercosis por la ingestión de huevos de Taenia solium (3) (Figura 1). De este modo, los huevos ingeridos eclosionan y liberan las larvas a nivel intestinal, la cuales atraviesan el epitelio del intestino delgado y llegan al torrente sanguíneo (2). Así, se dirigen principalmente a los músculos y al sistema nervioso central (SNC). En humanos, la infección con cisticercos a nivel del SNC se denomina neurocisticercosis (NCC)(4). 2 Figura 1. Ciclo biológico de Taenia solium: Cisticercosis / Neurocisticercosis. Imagen obtenida del documento “Directrices de la OMS sobre el manejo clínico de la neurocisticercosis por Taenia solium (2022)” publicado la Organización Mundial de la Salud. DOI: https://doi.org/10.37774/9789275325247. 1.2. Neurocisticercosis La NCC es considerada una enfermedad neurológica de gran impacto en la salud pública y es la principal causa de epilepsia secundaria en el mundo (5–7). La NCC ocurre a consecuencia de que una persona ingiere alimentos contaminados con huevos de Taenia solium, que posteriormente, eclosionan y atraviesan el epitelio intestinal, llegando al torrente sanguíneo hasta el SNC (8). Una vez ubicados en el SNC, el estadio del parásito se denomina cisticerco o quiste. Un paciente con NCC https://doi.org/10.37774/9789275325247 3 puede presentar uno o varios quistes, los cuales pueden ubicarse en el parénquima cerebral o ser extraparenquimales (intraventricular, espacio subaracnoideo, entre otros). La NCC extraparenquimal puede tener un peor pronóstico debido a su gran predisposición para producir complicaciones. Si las vesículas se alojan en las cisternas pueden crecer libremente hasta adquirir un tamaño gigante (> 50mm), dando lugar a la denominada forma racemosa (9) y puede generar, entre otros síntomas, hidrocefalia o hipertensión intracraneal (10,11). Por otra parte, la NCC parenquimal puede estar sin ser detectada por meses o años, y estar relacionado con síntomas como dolor de cabeza, convulsiones y/o epilepsia (12). I.2.1. Epidemiologia de la Neurocisticercosis La NCC es endémica en muchas zonas rurales en países de bajos recursos donde existe una crianza de cerdos no tecnificada y esto coexiste con deficientes condiciones de salubridad (13–15). La NCC es responsable de aproximadamente el 30% de casos de epilepsia en países en vías de desarrollo a nivel mundial (16). Así, se ha reportado endémica en zonas rurales del Sudeste Asiático (17,18), África Subsahariana (19–24) y Latinoamérica (7,25). Por otra parte, en países desarrollados la NCC es considerada una enfermedad emergente, cuyo número de casos han aumentado en los últimos años debido al incremento de personas provenientes de zonas endémicas (26,27). En Estados Unidos, el número de pacientes con NCC es aproximadamente entre 1300 a 5050 cada año, de los cuales más del 75 % corresponde a emigrantes (principalmente Latinos); por su parte en Europa se reporta una mayor incidencia de casos de NCC en Portugal y España, 4 con valores crecientes en los últimos años reportando casis no solo en inmigrantes sino también en nacidos en esos países (26,28,29). En América Latina, principalmente en zonas rurales, la NCC es endémica; no obstante, es una enfermedad desatendida. Se estima que alrededor de 0.45 a 1.35 millones de personas padecen de epilepsia a causa de la NCC (30). La mayor parte de los estudios de prevalencia/incidencia de NCC en América Latina se ha desarrollado en grupos de personas específicos como pacientes con epilepsia o con serología positiva (7,30–32). Aproximadamente, el 32.3 % de pacientes con epilepsia tienen NCC evaluados mediante TAC y 19.6 % mediante pruebas serológicas (33). Otro estudio, en una población del Ecuador, estimó una prevalencia 9.6 % de pacientes adultos con NCC evaluados mediante TAC y concluyo que los pacientes con epilepsia tenían 3 veces más posibilidad de tener NCC (34). En el Perú existen regiones endémicas como la costa norte y la sierra central donde cerca del 40% de casos de epilepsia son por NCC (35,36). La introducción de la prueba de Electro Inmuno Transferencia Blot (EITB) para el diagnóstico serológico (identificación de anticuerpos) en pacientes con NCC permitió el desarrollo de estudios poblacionales en varias zonas del Perú. Así un estudio realizado en la Selva peruana (comunidad de Maceda en Tarapoto) reportó tasas de seropositividad, es decir, presencia de una o más bandas de EITB, de 8% (37). Un estudio realizado un área hiperendémicas de teniasis/cisticercosis de la sierra peruana (comunidades de Huancayo, Junín) estimó una seroprevalencia de cisticercosis humana de 13.9% 5 en población general (38). Así también, un estudio desarrollado en una población adulta de una comunidad rural de la costa norte del Perú, en Tumbes, que es considerada un área endémica de cisticercosis, mostró una prevalencia de 23.1 % de NCC mediante TAC y 36.9 % mediante pruebas serológicas. Cabe resaltar que en más del 80 % de los casos positivos a serología fueron pacientes asintomáticos y presentaban únicamente lesiones inactivas (cisticercos calcificados) (39). 1.2.2. Sintomatología La presentación clínica de la NCC es variable. Los pacientes con NCC pueden ser inicialmente asintomáticos durante varios años y luego presentar diferentes manifestaciones neurológicas inespecíficas tales como: cefalea, ataxia, confusión, convulsiones y meningismo (12,40). Varios factores influyen en las manifestaciones clínicas de la enfermedad, tales como: el número, el tamaño, la ubicación y la forma de los parásitos y la respuesta inmunitaria del huésped (41). La interacción de estos factores afectan la variabilidad de la gravedad de los síntomas los cuales pueden ir desde infecciones totalmente asintomáticas o presentar convulsión, coma y hasta la muerte (40). Las convulsiones son el síntoma más frecuente y ocurren hasta en el 75 % de los pacientes con NCC. Se reporta que las convulsiones pueden comenzar hasta 30 años después de la infección inicial (40,42,43). La sintomatología puede variar dependiendo de la ubicación de los cisticercos a nivel del SNC, por ejemplo se ha reportado que pacientes con cisticercos extraparenquimales (intraventriculares o subaracnoideos) reportan síntomas como hidrocefalia y el aumento de la presión intracraneal, que se 6 desarrollan en alrededor del 25 % de los casos, los que pueden manifestarse con náuseas, vómitos y papiledema (10,11,40). Las crisis convulsivas son las manifestaciones clínicas más comunes en la NCC, las cuales ocurren en alrededor del 78.8 % de pacientes con NCC (44). Las convulsiones son poco frecuentes en individuos con solo quistes viables, muy frecuentes en casos con quistes en degeneración, y persisten en el 50% o más de los pacientes después de que los quistes se han resuelto (cuando el proceso inflamatorio cesa y la mayoría de los restos del quiste se reabsorben) (6,45). La epilepsia ocurre principalmente en pacientes con cisticercos cerebrales parenquimales (Figura 2) y en muchos casos representa el único síntoma de la enfermedad. Las convulsiones, que son uno de los síntomas más importantes de la epilepsia, son en su mayoría de tipo parcial; no obstante, algunas de las convulsiones pueden presentar generalización secundaria (46). Las personas con NCC parenquimatosa viable pueden permanecer asintomáticos por periodos prolongados de tiempo (meses o años), luego de lo cual el parásito pierde la capacidad de evadir a la respuesta inmune del hospedero; y en consecuencia, se inicia un proceso inflamatorio alrededor del quiste, lo que finalmente conduce a la degeneración y muerte del parásito (47,48). Algunos cisticercos desaparecen o se resuelven, es decir que el proceso inflamatorio desaparece y los restos de parásito se reabsorben (45,48). Mientras que otros se convierten en calcificaciones residuales (Figura 3). Se ha reportado que aproximadamente 20 % a 30 % de pacientes con NCC de lesión única y 40 % de 7 pacientes con lesiones múltiples, terminan en cicatriz calcificada bien definida que se observa fácilmente en la TAC (49). Estas calcificaciones residuales pueden convertirse en focos epileptogénicas y eventualmente desarrollar edema perilesional (48). Los mecanismos que involucran el desarrollo de crisis epileptogénicas en pacientes con NCC parenquimal no están aún establecidos; sin embargo, parecen estar relacionados a la activación de la respuesta inmune contra el cisticerco y el desarrollo de inflamación perilesional (48). Por otra parte, el tratamiento antiparasitario puede desencadenar una inflamación aguda a nivel del tejido nervioso; por lo cual debe ir acompañado de tratamiento antiepiléptico y antiinflamatorio (12). Existen otras manifestaciones clínicas menos frecuentes en la NCC tales como: déficit neurológico focal (aproximadamente 15% de los casos), déficit cognitivo (5%) y/o el incremento en la presión intracraneal (12%) (44). En pacientes con NCC extraparenquimal los cisticercos tienen localización subaracnoidea o ventricular, generalmente en la base del cerebro o en la fisura de Silvio y pueden alcanzar un gran tamaño (Figura 2) (50,51). En estos pacientes, el desarrollo de crisis epilépticas es menos frecuente, mientras que el desarrollo de hidrocefalia e hipertensión intracraneal es más común debido al efecto en masa que ocasionan y al bloqueo del flujo de líquido cefalorraquídeo (51,52). Por esta razón, algunos casos con NCC extraparenquimal requieren intervención quirúrgica. 8 Figura 2. NCC parenquimal (A) y NCC extraparenquimal (B) observadas mediante RM sin contraste. Imagen obtenida del artículo “Pathogenesis of Taenia solium taeniasis and cysticercosis” publicado Gonzales et al. DOI: 10.1111/pim.12307 Figura 3. NCC calcificada observada (dos lesiones que se observan con círculos blancos) mediante TAC sin contraste. Imagen obtenida del artículo “Neurocysticercosis” publicado García et al. DOI: 10.1016/j.ncl.2018.07.003 A B 9 1.2.3. Inmunopatología de la Neurocisticercosis Los mecanismos patogénicos en la NCC son variables y dependen de la ubicación del parásito (dentro o fuera del parénquima nervioso), su volumen y la respuesta inflamatoria del huésped; asimismo esto se relaciona a la etapa evolutiva del parásito (viabilidad) (53). En la NCC, los cisticercos se establecen en el SNC, sobreviven durante un periodo extremadamente variable (desde meses a muchos años) y finalmente se resuelven mediante un proceso involutivo reabsorbiéndose o dejando una cicatriz calcificada (53). Los cisticercos viables utilizan múltiples mecanismos activos de evasión de la respuesta inmune (6). Dentro de los mecanismos descritos se reporta la secreción de moléculas capaces de bloquear el sistema del complemento, afectar la respuesta celular, aumentar las células T reguladoras, degradar las inmunoglobulinas atacantes (proteasas que escinden inmunoglobulinas, la proteasa inhibidores y antioxidantes, factores inmunosupresores y otras moléculas como paramiosina, proteoglicanos sulfatados, prostaglandina E 2, taeniaestatina y neuropéptidos como la sustancia P y la somatostatina) (6,54) o incluso enmascararse cubriéndose con inmunoglobulinas del huésped (53,55). Los quistes parenquimales viables, eventualmente degeneran y se resuelven, ya sea por involución natural o debido al tratamiento antiparasitario (56,57). Los parásitos muertos se resuelven por completo generalmente, o dejan una cicatriz calcificada (6,58). La muerte del parásito implica inflamación perilesional y se asocia frecuentemente con la aparición o exacerbación de síntomas neurológicos (57). 10 Mediante análisis de imágenes, algunos autores consideran que un quiste degenerado presenta cambios en la apariencia del líquido quístico. Así, reportan que la ausencia de señal de contenido líquido (hipodensa mediante TAC o hiperintenso en T2 mediante RM) son marcadores de degeneración parasitaria (59); por lo que, los quistes que muestran contenido líquido se consideran quistes viables (con o sin inflamación) y la ausencia de contenido líquido representaría a un quiste en degeneración (59). La respuesta inflamatoria del hospedero usualmente asocia a sintomatología neurológica. La respuesta inflamatoria periquística o edema perilesional, ya sea alrededor de quistes viables o calcificados, se asocia a la aparición o exacerbación de convulsiones y otros síntomas. En pacientes sintomáticos, es frecuente encontrar edema perilesional y realce de contraste alrededor de al menos uno de los quistes. En pacientes con NCC calcificada, es más frecuente encontrar edema perilesional que inflamación luego de un evento convulsivo, algunos investigadores consideran al edema alrededor del quiste calificado como una respuesta inmunitaria episódica a los antígenos del parásito que permanecen en la cicatriz calcificada (6,34,60) . Los quistes extraparenquimales, por su ubicación, ejercen una sintomatología y respuesta inmune distinta en el paciente. Estos se localizan en los ventrículos cerebrales o en los espacios subaracnoideos. Los quistes intraventriculares (especialmente los del 3° y 4° ventrículo) pueden causar hidrocefalia o pueden causar síntomas debido a la compresión directa del tronco encefálico. Respecto a su tamaño pueden crecer has ampliamente (> de 1 cm) debido a que tienen más 11 espacio y menos presión del tejido circundante. Es importante discernir si los quistes están adheridos a la pared o flotan libremente, lo cual se relaciona también a la inflamación circundante. El grado de inflamación puede ser importante para la resección quirúrgica (neuroendoscópica), dado que los quistes extraparenquimales con inflamación circundante pueden ser adherentes, difíciles de extirpar y propensos a sangrar (6,51,52). Por su parte, los quistes subaracnoideos se ubican generalmente en las fisuras de Silvio, las cisternas basales y los espacios interhemisféricos, los cuales tienden a formar grandes agregados (quistes o grupos de quistes “gigantes”) (6,51,52). 1.2.3.1. Inflamación y factores del hospedero Además de la ubicación y viabilidad parasitaria, existen algunos factores del huésped que pueden influir en la respuesta inmune del mismo, que en consecuencia pueden afectar la inmunopatología de la NCC y viabilidad del parásito. El sexo y la edad del paciente son variables que pueden afectar la respuesta inmune frente a la infección parasitaria ocasionada por el cisticerco de Taenia solium e influir en el estado de viabilidad del parásito. Un estudio reportó que en pacientes con NCC, las mujeres más frecuentemente presentaron inflamación en el LCR y un nivel de recuento de leucocitos en el LCR significativamente mayor en comparación con los hombres (61). Estas observaciones se encuentran en línea con lo descrito en estudios previos en los que los factores sexuales se han asociado con la intensidad de la respuesta inflamatoria contra el parásito, posiblemente promovida por los niveles de esteroides sexuales 12 femeninos (62–65). De esta forma, se considera que el sexo es un factor de riesgo que influye en la gravedad de la respuesta inflamatoria dentro del parénquima cerebral a una enfermedad parasitaria (62). Por lo tanto, hay indicios de que el género puede estar involucrado en la patogénesis de la NCC, pero se necesitan más estudios para confirmar estos hallazgos. La edad también es un factor que influye en la respuesta inmune y está relacionada a la madurez del sistema inmune. Se ha descrito que la edad participa en la heterogeneidad de la sintomatología clínica en pacientes con NCC sintomática. Así, se observó que las lesiones múltiples y los cisticercos ventriculares múltiples se presentaron en mayor frecuencia en pacientes de mayor edad sin un aumento de la severidad de los síntomas clínicos(61). Un estudio reportó que la intensidad de la respuesta inflamatoria disminuye alrededor de los cincuenta años, lo cual estaría relacionado no solo a la edad sino también al género; dado que pasado los 50 años, las mujeres entran en etapa menopaúsica y el nivel hormonal cambia hacia a un perfil más androgénico, según hipotetizan algunos investigadores(62). Estudios en otras parasitosis como esquistosomiasis reportan que la edad tienen un efecto inverso en la susceptibilidad a la infección y la resistencia con enfermedades graves (66,67). 1.2.3. Agente causal: Cisticerco de Taenia solium 13 La descripción del cisticerco de Taenia solium estará enfocada en su estructura histológica y las glicoproteínas que contiene, y que han sido utilizadas para el diagnóstico de NCC, las cuales serán evaluadas en la presente investigación. 1.2.3.1 Estructura del cisticerco Los cisticercos de Taenia solium son vesículas traslucidas llenas de líquido que miden entre 1 a 3.5 cm, con un escólex invaginado y son generalmente de forma oval (68,69) (Figura 4). A nivel histológico, están conformados por una membrana o pared quística, un espacio vesicular conteniendo líquido y un escólex que tiene cuatro ventosas y un rostelo armado con dos filas de ganchos (69) (Figura 4). La membrana en su parte más externa (tegumento), presenta unas proyecciones denominadas microtrichas (Figura 5). Por debajo de las microtrichas se encuentra la membrana basal y el parénquima de la membrana. La zona del parénquima contiene fibras musculares circulares y longitudinales, células responsables de la formación de corpúsculos calcáreos, células del parénquima, células del tegumento, células flama, conductos excretores y gránulos de glucógeno (68). A B 1 2 14 Figura 4. Cisticerco de Taenia solium. Figura A. Cisticercos en solución salina obtenidos de músculo de cerdo naturalmente infectado. Vista de un pocillo de una placa de 6 pocillos. Figura B. Estructura histológica de un cisticerco; 1: escólex, 2: membrana. Tinción H-E, 40X. Imágenes proporcionadas por el Laboratorio de Inmunopatología Experimental (LIPE) de los Laboratorios de Investigación y Desarrollo (LID) de la Universidad Peruana Cayetano Heredia (UPCH). El cisticerco viable, in vitro, muestra movimientos lentos y continuos de contracción y relajación, gracias a la doble capa de fibras musculares, ubicadas justo debajo de la superficie del tegumento descritas anteriormente(69). Cuando el cisticerco es expuesto a la tripsina o la bilis, las larvas evaginan y emerge el escólex del canal espiral. Se presume que, in vivo, el proceso de evaginación libera el escólex en el duodeno alentando su unión a la pared duodenal del huésped definitivo (el ser humano). Figura 5. Estructura del cisticerco de Taenia solium. Figura A. MI: microtrichas, MZ: zona de la matriz, MC: fibras musculares, 10000X. Figura B. Se muestran células del parénquima, 6000X. Imagen obtenida del artículo “Morphological A B 15 Changes to Early Stage Taenia solium Cysticerci Following Oxfendazole Treatment” publicado Liu et al. DOI: 10.1016/s1090-0233(02)00124-7 La superficie tegumentaria es utilizada por el parásito para tomar nutrientes de los tejidos intersticiales del huésped (70,71). Por lo tanto, es necesaria una superficie tegumentaria intacta para su supervivencia, dado que los parásitos son acelómicos y no tienen sistema digestivo (69). El tegumento del cisticerco está cubierto por un glicocálix estructurado (69). La glicocálix es sensible a la acción de la tripsina a concentraciones bajas con lo cual las microtrichas colapsan y se aglutinan (Ver Figura 5). Se ha reportado que el glicocálix está compuesto por glicoproteínas, que son reconocidas por sueros de pacientes con NCC y han sido purificadas y utilizadas para el diagnóstico (72,73). La detección de anticuerpos en suero contra la etapa larvaria (cisticercosis) se utiliza ampliamente como ayuda en el diagnóstico de NCC y ha demostrado ser útil en estudios epidemiológicos de NCC en áreas endémicas (74,75); no obstante, estos anticuerpos no parecen tener un papel relevante en la protección o destrucción de cisticercos establecidos a causa de los diversos mecanismos de evasión que han desarrollado los metacéstodos contra células o moléculas inmunes (69). 1.2.3.2. Glicoproteínas del cisticerco de Taenia solium Se han caracterizado y evaluado diversas glicoproteínas de los cisticercos de Taenia solium, y de otras tenías, para su uso en el inmunodiagnóstico de la NCC y/o el desarrollo de vacunas sintéticas o recombinantes contra la cisticercosis (76). 16 Las glicoproteínas más ampliamente utilizadas, particularmente para el diagnóstico de NCC, son aquellas que se obtienen de un extracto parcialmente purificado de cisticercos de Taenia solium. Específicamente, la fracción de glicoproteínas con afinidad a la lectina de lenteja (LLGP, por sus siglas en ingles). Estas se emplean en el diagnóstico de la NCC mediante la prueba de EITB (73), esta prueba se describirá en detalle más adelante en la sección I.3 diagnóstico de la NCC. Las glicoproteínas con afinidad a la lectina de lentejas se separan en 7 bandas antigénicas denominadas GP50, GP39-42, GP24, GP21, GP18, GP14 y GP13, llamados así por su naturaleza glicoproteicas (GP) y su respectivo peso molecular en kDa (73). Esta glicoproteínas pertenecen a 3 familias: familia GP50, familia T24/42 y familia 8 kDa(77). A partir de esta fracción glicoproteica se han caracterizado varias glicoproteínas de Taenia solium con el objetivo de producir sintética o recombinantemente polipéptidos que sirvan para el diagnóstico, mediante pruebas rápidas, que no dependan de tener el material biológico (cisticercos) para su obtención (78). Los antígenos 8 kDa es una familia de glicoproteínas antigénicas que ha sido caracterizada y clonada. Hancock et al. informaron que los miembros de la gran familia de antígenos denominados 8 kDa incluyen a las glicoproteínas LLGP que migran a 14, 18 y 21 kDa, los cuales son componentes de las bandas de proteínas encontradas a 24 y 39–42 kDa (79). Los antígenos de 8 kDa son las proteínas de diagnóstico que se observan a 14, 18 y 21 kDa en el Western blot y también se encuentran en las bandas de 24 y 39 a 42 kDa (79). Los investigadores informaron 17 la identificación de genes de 18 proteínas maduras únicas, de las cuales 9 fueron sintetizadas químicamente y evaluadas en un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA, por sus siglas en inglés) frente a muestras de suero de pacientes con cisticercosis reactiva a los antígenos 8 kDa de LLGP en western blot, sueros de pacientes con otras infecciones parasitarias y sueros controles sanos. Las 9 proteínas sintetizadas fueron: Ts18, Ts18 var1, Ts18 var3, Ts18 var4, Ts18 var6, TsRS2 var1, Ts14, Ts18 var8 y TsRS1. Uno de los antígenos identificados (TsRS1) mostró ser 100 sensible y 100 % especifico (79). Posteriormente, Hancock et al. caracterizaron y clonaron la glicoproteína GP50. La GP50 es una proteína de membrana glicosilada que se encuentra anclada al glucolípido glicosilfosfatidilinositol (GPI, por sus siglas en inglés). La clonación de esta proteína mostró un clon genómico de 3193 nucleótidos de longitud, que tiene al menos 12 exones y 11 intrones (80). La capacidad antigénica de la GP50 depende de su estructura secundaria y terciaria (correcta formación de enlaces disulfuro) y no de la estructura primaria; por lo que la estructura secundaria y terciaria contiene todos los epítopos reconocidos durante la respuesta inmune frente a la infección con cisticercos de Taenia solium. Tanto la proteína nativa (purificada de cisticercos) como la proteína recombinante mostraron ser antigénicas frente a sueros de pacientes con NCC y no frente a pacientes con teniasis (80). La sensibilidad de la proteína GP50 recombinante fue de 90 % para detectar suero de pacientes con cisticercosis. Hancock et al. indicaron que 1 de las 10 muestras evaluadas, todas reactivas a GP50 nativa, no fue reactiva con la GP50 recombinante. Por lo tanto, sugieren que los restos de carbohidratos de GP50, así como el anclaje a GPI, pueden 18 desempeñar un papel en la antigenicidad de esta glicoproteína, tomando en cuenta otros estudios que evidencia que los glicanos contribuyen a la antigenicidad de las proteínas (80). Así también, se mostraron que la GP50 recombinante fue 100 % especifica cuando se enfrentó a suero de pacientes con otras infecciones como Taenia saginata y el género estrechamente relacionado, Echinococcus (80). En términos generales las GP50 ha mostrado una reactividad entre 53 % al 84% de las muestras de suero de infección (73,81,82). Por otro lado, la proteína T24 es una proteína integral de membrana que pertenece a la superfamilia de tetraspanina, cuyo dominio extracelular, fue expresado recombinantemente en Echerichia coli (83). Migra en una posición correspondiente a 24 kDa y como homodímero en 42 kDa en LLGP-EITB (83). Tanto la forma nativa como la fracción recombinante (rT24H) presentan en su estructura secundaria los enlaces disulfuro necesarios para su reconocimiento por los anticuerpos (83). La proteína es una de las implicados en el establecimiento de la etapa larvaria y que también se expresan en gran medida en diversos estudios (84). La utilidad de evaluar la proteína T24 o su forma recombinante, se ha observado también en la evaluación cualitativa de las bandas positivas en LLGP-EITB. Greene et al. describieron la caracterización de dos glicoproteínas de 14 y 18 kDa. Ellos mostraron que, si bien estas subunidades de 14 y 18 kDa comparten una homología de secuencia de aminoácidos, su migración diferencial en un gel de poliacrilamida muestra que son entidades claramente diferentes. Esto debido a diferencias en las longitudes de la cadena de aminoácidos y/o diferencias en las 19 modificaciones postraduccionales. Asimismo, señalaron que estas subunidades conservadas se combinan para eventualmente crear estructuras multiméricas que difieren en masa molecular que varía en tamaño de 20 a 50 kDa. Ambas subunidades mostraron reactividad contra sueros de pacientes con NCC (78). Posteriormente, se sintetizaron polipéptidos sintéticos (sTS14 y sTS18) a partir de la secuencia de aminoácidos de estas subunidades de 14 y 18 kDa, de los cuales la sTS14 mostró ser reactiva frente a sueros de pacientes con NCC sin reacción cruzada frente a otras infecciones parasitarias (85). Otros investigadores han sintetizado antígenos de Taenia solium a partir de una librería genética, identificando tres antígenos denominados Ts8B1, Ts8B2 y Ts8B3 los cuales guardan homología en un 75 % con el antígeno CyDA y 50% con antígenos de la familia de 8kDa de Taenia solium. Específicamente, el antígeno Ts8B2 presentó la característica de ser un antígeno de E/S y tuvo una sensibilidad del 96.8 % y una especificidad del 93.1 % en la detección de NCC activa (86). 1.3. Diagnóstico de la Neurocisticercosis Históricamente, la NCC se diagnosticaba mediante la autopsia del paciente (87). Actualmente, se cuentan con dos técnicas que permiten el diagnóstico, estas son: los estudios de imágenes a través de la RM y la TAC; y el inmunodiagnóstico basado en la prueba de EITB que utiliza una mezcla de antígenos parcialmente purificados (87). A continuación, se describirán las técnicas para el diagnóstico de 20 la NCC con especial énfasis en el diagnóstico de infección viable, que corresponde con el objetivo de la presente investigación. 1.3.1. Neuroimágenes: diagnóstico de infección viable El término "viable" se utiliza para describir a las larvas que están vivas y activas, lo que significa que pueden seguir creciendo y causar daños en el cuerpo. Cuando las larvas mueren o se calcifican, se habla de neurocisticercosis inactiva (88). En la NCC, se considera infección viable cuando existe uno o más cisticercos viables en el SNC y puede ser diagnosticada mediante una combinación de pruebas de diagnóstico, como la tomografía computarizada (TC) y el resonancia magnética (RM) (12). Mediante la RM un cisticerco viable se puede observar como una lesión hipointensa en T1 e hiperintensa en T2 con una apariencia quística. Según el estado de maduración del cisticerco, la imagen puede variar. Por ejemplo, un cisticerco viable joven puede tener una pared fina y regular, mientras que uno más antiguo puede tener una pared gruesa y calcificada. Asimismo, la RM puede proporcionar información adicional sobre la respuesta inflamatoria del cuerpo a la presencia del cisticerco, como la presencia de edema, reacción inflamatoria o efectos de masa en los tejidos circundantes. La resonancia magnética es considerada el método de elección para el diagnóstico de la NCC viable debido a su alta sensibilidad y especificidad para la detección de lesiones quísticas en el sistema nervioso central (46). 21 El diagnóstico de NCC viable ocurre generalmente en pacientes sintomáticos que acuden al hospital. Esto contrasta con lo que ocurre en la población general, en donde el mayor porcentaje de casos con NCC son asintomáticos y presentan lesiones inactivas (34,39). El diagnóstico de NCC viable en pacientes hospitalarios permite que reciban el mejor tratamiento mediante el uso de esquemas con antiparasitarios altamente eficaces como albendazol y praziquantel y un manejo clínico apropiado de los síntomas mediante el uso de antiinflamatorios y antiepilépticos (6,59,89). El tratamiento antiparasitario induce la muerte y resolución del cisticerco, lo que a su vez permite mejorar la evolución clínica del paciente(59). El diagnóstico de viabilidad en NCC humana en entornos hospitalarios se basa principalmente en los hallazgos de neuroimágenes en combinación con los resultados de pruebas serológicas (90,91). Tanto la RM como TAC proporcionan evidencia objetiva sobre la presencia de cisticercos en el SNC, su localización, número, fase de desarrollo y el grado de respuesta inflamatoria alrededor (12,91) (Figura 6 y 7). La RM es más sensible para el diagnóstico de NCC viable (tanto en infecciones parenquimales como extraparenquimales), ya que permite visualizar las lesiones en diferentes planos, mientras que la TAC es más sensible para detectar lesiones cerebrales calcificadas y su sensibilidad en infecciones viables es menor que la RM (6,91). El diagnóstico de viabilidad en NCC, tomando en cuenta solo los resultados de hallazgos imagenológicos, es definitivo cuando las neuroimágenes indican la presencia de un cisticerco con su escólex invaginado(12,92). 22 Figura 6. Hallazgos de neuroimágenes en NCC. (A, B) visualización de cisticercos viables en resonancia magnética. Imagen obtenida del artículo “Imaging findings in neurocysticercosis” publicado Garcia et al. DOI: 10.1016/s0001-706x(03)00057-3 A B A B 23 Figura 7. Hallazgos de neuroimágenes en NCC. (A, B) visualización de cisticercos viables en tomografía axial computarizada. Imagen obtenida del artículo “Imaging findings in neurocysticercosis” publicado Garcia et al. DOI: 10.1016/s0001- 706x(03)00057-3 Por otro lado, las neuroimágenes también tienen limitaciones. En algunas ocasiones las neuroimágenes no siempre pueden diferenciar NCC de otras lesiones en el SNC y, en algunos casos, las lesiones de NCC pueden pasar desapercibidas por la TAC o la RM. Cuando los hallazgos de neuroimágenes (TAC o RM) no son concluyentes o no se cuentan con técnicas precisas para medir viabilidad como la RM, éstas requieren confirmación mediante pruebas serológicas, como la EITB, las cuales proporcionan información adicional sobre la viabilidad del parásito (93) y pueden apoyar a los hallazgos de neuroimágenes para determinar la opción de tratamiento adecuado en el paciente(6,94). Sin embargo, es importante señalar que ante la ausencia de neuroimágenes, los resultados serológicos no pueden dictaminar la decisión sobre el manejo terapéutico del paciente (95). 1.3.2. Pruebas serológicas: generalidades y utilidad para el diagnóstico de infección viable Las pruebas serológicas se basan en la detección de anticuerpos en suero por diferentes metodologías. En relación a la vida media de estos anticuerpos, puede ser variable considerablemente, dependiendo de factores como la intensidad de la infección, la respuesta inmune del individuo y se ha administrado tratamiento antiparasitario (87,96). En pacientes con NCC, algunas personas con infecciones 24 que involucran múltiples cisticercos pueden tener anticuerpos persistentemente detectables en LLGP-EITB por años después de un tratamiento antiparasitario exitoso, mientras que otros pueden volverse sero-negativos después de aproximadamente 9 meses (87). Los anticuerpos contra los antígenos de 8 kDa son los primeros en desaparecer; en segundo lugar, los anticuerpos contra GP24 y GP42-39 (87). Los anticuerpos contra GP50 son los más persistentes. En términos generales, la detección de anticuerpos resulta útil como indicador de que un individuo ha sido infectado por un parásito especifico. Un resultado positivo en alguien no expuesto previamente al parásito antes de un viaje reciente a una zona endémica puede interpretarse una probable infección reciente. Sin embargo, en una persona nativa de un área donde el parásito es endémico puede mostrar sólo una infección pasada no relacionada con el estado clínico actual (96). Además, aproximadamente el 40 % de los resultados positivos en una zona endémica son por anticuerpos transitorios, que se vuelven indetectables al cabo de un año (97). En general, la detección de anticuerpos contra enfermedades parasitarias indica sólo una infección en algún momento indeterminado y no necesariamente una infección aguda o actual. Los niveles de anticuerpos contra los parásitos disminuyen lentamente una vez que el paciente se cura de la infección; aunque, generalmente permanecen al menos entre 6 meses y muchos años, dependiendo del parásito infectante y, por lo tanto, generalmente no son indicadores útiles para determinar una curación exitosa; sino más bien son útiles para el diagnóstico. 25 Electro Inmuno trasnferencia Blot (EITB): La EITB es el ensayo preferencia para detección de anticuerpos en NCC. El EITB detecta bandas de anticuerpos dirigidos contra siete glicoproteínas del cisticerco de Taenia solium purificadas con lentil-lectina y separadas según su peso molecular mediante electroforesis en geles de poliacrilamida (73). El EITB ha sido utilizada en estudios serológicos de NCC debido a su alta sensibilidad y especificidad para un resultado positivo a 1 o más bandas (98% y 100%, respectivamente) y para pacientes con 2 o más cisticercos, por lo cual se prefiere como herramienta complementaria a los hallazgos de neuroimágenes (73,98). Actualmente, el ensayo de EITB es reconocido por la Organización Panamericana de la Salud como el método inmunológico de elección para el diagnóstico de NCC (99). Cabe señalar que, la EITB no es la única prueba serológica diseñada para detectar anticuerpos, existen también formatos comerciales de inmunoabsorbancia ligada a enzima (ELISA). No obstantes las pruebas de ELISA utilizan antígenos de detección menos purificados en comparación con la EITB, lo que resulta en una menor sensibilidad y en un alto porcentaje de falsos positivos debido a la reacción cruzada con otros cestodos como Echinococcus granulosus y Hymenolepis nana (100). Como se comentó previamente, el ensayo de EITB detecta anticuerpos contra siete antígenos glicoproteicos del cisticerco de Taenia solium obtenidos mediante purificación en electroforesis con lentil-lectina (LLGP) (73), por lo cual se le conoce también como ensayo LLGP-EITB. Las bandas de glicoproteínas en el 26 LLGP-EITB son denominadas en función de su peso molecular en kilodaltons como GP50, GP42-39, GP24, GP21, GP18, GP14 y GP13 (73). Figura 8. Bandas de glicoproteínas utilizadas en LLGP-EITB y la familia de glicoproteína a la que pertenece cada una. LLGP-EITB: lentil lectin-bound glycoproteins/enzime-linked immunoelectrotransfer blot. Como parte inicial del proceso para la obtención de los antígenos utilizados en LLGP-EITB, los cisticercos recolectados de cerdos se solubilizan en urea (extractos antigénicos), y la fracción unida de la cromatografía de afinidad de lectina de lenteja, es decir, las glicoproteínas purificadas de lectina de lenteja, se usa como antígeno en un ensayo de transferencia Western o inmunoelectrotransferencia ligada a enzimas. Mediante el proceso de electroforesis en geles de poliacrilamida, 27 las glicoproteínas antigénicas migran y se separan según su peso molecular, posteriormente estas glicoproteínas son transferidas de los geles de poliacrilamida a membranas de nitrocelulosa. Con la obtención de las tiras de nitrocelulosa que contienen las glicoproteínas de Taenia solium se procede a realizar el ensayo de LLGP-EITB. Para evaluar la presencia de anticuerpos anti-Taenia solium en los sueros de pacientes, se realiza la incubación de las muestras con las glicoproteínas contenidas en las membranas de nitrocelulosa. La incubación se realiza durante toda la noche, y luego de un posterior paso de incubación con anti-IgG (humano) y revelado se visualizan las bandas de anticuerpos. La visualización de 1 o más bandas de anticuerpos establece un diagnóstico positivo de cisticercosis con una sensibilidad y especificidad de 98% y 100%, respectivamente, para detectar pacientes con NCC con 2 a más cisticercos (73,98). Siendo así, una prueba cualitativa para el diagnóstico de NCC. No obstante, la prueba de EITB no solo brinda información cualitativa respecto al diagnóstico de NCC, sino también brinda información adicional que permite orientar el diagnostico hacia la presencia de infección viable en NCC, a través de la evaluación del patrón de bandas. La evaluación del patrón de bandas en EITB permite orientar el diagnóstico hacia una posible infección viable o no viable. Los pacientes con NCC pueden expresar de 1 a 7 bandas en EITB. Al evaluar la expresión de estas bandas, se han identificado patrones bandas que puedes ser agrupados en 4 clases. El patrón clase 28 1 con ninguna banda positiva o GP50 positivo; el patrón clase 2 con GP42-39 y GP24 positivos o GP50 y GP42-39 positivos o GP50, GP42-39 y GP 24 positivos; el patrón clase 3 con GP50, GP42-39, GP24 y GP13 positivos o GP50, GP42-39, GP24, GP14 y GP13 positivos; y el patrón clase 4 con GP50, GP42-39, GP24, GP21, GP14 y GP13 positivos o GP50, GP42-39, GP24, GP21 y GP18 positivos o GP50, GP42-39, GP24, GP21, GP18 y GP14 positivos o GP50, GP42-39, GP24, GP21, GP18, GP14 y GP13 positivos (93). Estos patrones de anticuerpos en LLGP-EITB permiten orientar el diagnóstico hacia infección viable. Luego de evaluar los resultados de 548 pacientes con NCC, se informó que aproximadamente solo el 8 % de los pacientes con un patrón de anticuerpos clase 1 tenía cisticercosis viables, en contraste, el 80.0 % y 81.4 % de los pacientes con un patrón de anticuerpos clase 3 y 4, respectivamente, tenían cisticercos viables. Por otra parte, alrededor del 50% de los pacientes con un patrón de anticuerpos clase 2, presentaron cisticercos viables (93). Con estos hallazgos, evaluar los patrones de bandas puede ser de utilidad para orientar el diagnostico hacia una posible infección viable, específicamente, para aquellos con patrones clase 1, 3 o 4. No siendo así para aquellos con un patrón clase 2. Sobre el aspecto metodológico, la prueba de LLGP-EITB si bien es altamente sensible y específica para el diagnóstico de NCC (en general) depende del suministro de cerdos naturalmente infectados para la obtención de antígenos de cisticercos; además, la preparación del antígeno y la realización del Western blot requieren una experiencia técnica considerable. Estos aspectos pueden ser relevantes al momento de implementar la prueba para algún tipo de estudio. En ese 29 sentido, actualmente existen antígenos recombinantes y sintéticos que están siendo evaluados para su uso en el diagnóstico de NCC (77,101,102). Detección de antígeno circulante: Por otra parte, además de la detección de anticuerpos (mediante LLGP-EITB) también se puede identificar antígenos del parásito en el suero de pacientes. La detección de antígeno en suero puede indicar la presencia de infección viable en el hospedador mediante el reconocimiento de productos excretorios/secretorios del parásito (87). Los resultados iniciales sobre la detección de antígeno parasitario circulante se basaron en el uso de anticuerpos policlonales, los cuales mostraron un mejor desempeño en líquido cefalorraquídeo que en suero. Posteriormente, el desarrollo de anticuerpos monoclonales mejoró sustancialmente la especificidad de los ensayos de detección de antígeno como herramienta diagnóstica para NCC con niveles aceptables de sensibilidad y especificidad (entre 82 %-86 % y 88 % -92 %, respectivamente) (103,104). A diferencia de la detección de anticuerpos mediante LLGP-EITB cuyos niveles de sensibilidad son determinados por la respuesta inmune del hospedero, la sensibilidad de los ensayos de detección de antígeno generalmente es menor, ya que depende directamente de la cantidad de antígeno producido por el parásito (87) siendo esta menor en infecciones cerebrales únicas. Así también, la cantidad de antígeno del parásito en suero de pacientes con NCC puede reducirse rápidamente luego del tratamiento con antihelmínticos, por lo que, los ensayos de detección de antígeno son utilizados también para monitorear la eficacia posterior al tratamiento antiparasitario (105). 30 1.3.3. Nuevas metodologías de detección de anticuerpos (multiplex bead-based assay) en neurocisticercosis Con el avance tecnológico en el diagnóstico de infecciones, se han desarrollado nuevas metodologías que ofrecen resultados de alta precisión y mayor sensibilidad diagnostica, tales como el inmuno ensayo basado en perlas magnéticas (multiplex bead-based assay [MBA]). La metodología MBA, que emplea el uso de perlas magnéticas como soporte, permite cuantificar de manera múltiple diferentes tipos de anticuerpos, entre otras moléculas, utilizando una serie de antígenos de detección en un solo ensayo, empleando una sola muestra de suero. Cada perla, asignada por color fluorescente, puede servir de soporte a un distinto tipo de antígeno. La detección de la perla (identificación del tipo de antígeno de detección adherido a la perla) y la concentración de anticuerpos adheridos a la superficie de la perla (identificación de la cantidad de anticuerpo específico unido al antígeno de detección) se identifican a través de reacciones fluorescentes (106). El equipo por el cual se detectan dichas fluorescencias, denominado Luminex, detecta dos tipos de emisiones fluorescentes (del centro y superficie de la perla) (107). El multiplex bead-based assay se ha utilizado en estudios de neurocisticercosis para detectar múltiples biomarcadores en muestras de suero de pacientes con esta enfermedad (102,108,109). En un estudio publicado en el 2018, se utilizó un panel de MBA para detectar la presencia de anticuerpos específicos contra Taenia solium y otros patógenos en 805 estudiantes de escuelas primarias de África. 31 Específicamente, para Neurocisticercosis, se incluyó el antígeno T24H recombinante (rT24H) acoplado al glutatión S transferasa de Taenia solium. En términos generales el 8.0 % de niños dio positivo a rT24H, aunque en algunas escuelas se alcanzó un porcentaje entre 25 % y el 30 %. El punto de corte para la GST-rT24H determinado para definir muestras "positivas" fue 1068 MFI-bg. La mediana de MFI-bg de todos los estudiantes para GST-rT24H fue 238 y el rango de MFI-bg fue de 31 a 21168. Los investigadores concluyeron que esta metodología (MBA) es una excelente plataforma serológica que brinda oporunidades rentables para el desarrollo de encuestas serológicas (108). Otro estudio buscó comparar el uso de diferentes moléculas recombinantes para el diagnóstico de Neurocisticercosis en distintas plataformas: ELISA, Western Blot y MBA. Empleando tres antígenos recombinantes (T24H-his, GST-Ts8B2 y GST- T24H) los resultados mostraron que los tres fueron sensibles para detectar anticuerpos en sueros de pacientes con NCC con múltiples cisticercos viables. La proteína GST-T24H, mediante la plataforma MBA, mostró una sensibilidad del 96,1% para el diagnóstico de pacientes con dos o más quistes viables. Además, fue el antígeno con mayor sensibilidad para detectar sueros de pacientes con un solo quiste viable y solo quistes no viables calcificados. En segundo lugar se encontró el antígeno T24H-his (84.4 %) y en tercer lugar el antígeno GST-Ts8B2 (46.8 %) (102). Un estudio buscó evaluar la precisión diagnostica de la metodología MBA en comparación con pruebas comerciales de ELISA para el diagnóstico de NCC y 32 Equinococosis quística. Para el diagnóstico de NCC mediante MBA se empleó el antígeno recombinante rT24H. Los resultados mostraron una sensibilidad entre 57.94 % y 63.49 % para rT24H-MBA y entre 40.48 y 46.03 % para la prueba comercial de ELISA según el grupo de sueros analizados; las especificidades estuvieron entre 90.87 % y 91.30 % y entre 70.43 % y 76.96 %, respectivamente. Los investigadores concluyeron que los antígenos recombinantes evaluados utilizados mediante MBA mostraron una mejor precisión diagnóstica que los ensayos comerciales de ELISA, particularmente para el diagnóstico de NCC (109). En general, el uso del multiplex bead-based assay en neurocisticercosis permite la detección simultánea de múltiples biomarcadores en suero de los pacientes, aunque también tiene el potencial de poder aplicarse a otros tipos de muestras, lo que puede ayudar en el diagnóstico y la comprensión de la patogenia de esta enfermedad. 1.4. Pacientes non neurocisticercosis con patrón de anticuerpos Clase 2 Los pacientes con patrón de anticuerpos clase 2 corresponden al segundo grupo más frecuente de pacientes con NCC, siendo aproximadamente el 27 % del total de pacientes (93). Estos pacientes presentan en LLGP-EITB de 2 a mfi positivas contra las glicoproteínas de mayor peso molecular, es decir, contra GP50, GP42-39 y GP24. Según esta distribución de bandas positivas en LLGP-EITB presentan 3 subgrupos: i-) GP42-39 y GP24, ii) GP50 y GP42-39 y iii) GP50, GP42-39 y GP24. A diferencia de otros grupos de pacientes con NCC con otros patrones de bandas en LLGP-EITB, estos pacientes tienen similar probabilidad de tener o no infección 33 viable, por lo cual con solo este resultado es difícil orientar el diagnostico hacia una infección viable. Dado que la mitad de pacientes puede tener infección viable y la otra mitad no (93), se considera que este grupo podría presentar al menos dos subpoblaciones cuyas características, aun no estudiadas a profundidad, determinan una mayor o menor probabilidad de tener infección viable. Los pacientes con un patrón clase 2 pueden tener NCC intra o extraparenquimal. Aquellos pacientes con NCC extraparenquimal generalmente tienen infección viable y presentan 3 bandas. A la fecha, se ha descrito únicamente de manera cualitativa la respuesta de anticuerpos en este grupo de pacientes mediante los resultados en LLGP-EITB, no obstante, todavía no se ha evaluado su perfil de anticuerpos de manera cuantitativa. 34 II. HIPOTESIS GENERAL En pacientes con neurocisticercosis que presentan un patrón de anticuerpos de clase II, la presencia de cisticercos viables está relacionada a la distribución de anticuerpos detectados mediante LLGP-EITB y otras variables demográficas; asimismo, el perfil cuantitativo de anticuerpos permite identificar con buena precisión la presencia de cisticercos viables. 35 III. JUSTIFICACIÓN La NCC es una infección parasitaria del sistema nervioso central y la principal de causa de epilepsia adquirida (aproximadamente 30 %) en países de bajos recursos (110). Si bien el diagnóstico por imágenes permite visualizar las lesiones de la NCC, no siempre brindan un diagnóstico definitivo de infección viable (90,111,112) o se tienen un limitado acceso a estas tecnologías (95). Los pacientes con cisticercos viables reciben un tratamiento diferenciado que considera los posibles efectos secundarios debido a la muerte del parásito (i.e. exacerbación de síntomas neurológicos) producto del tratamiento antiparasitario (75,113,114). Es importante mencionar que el diagnóstico de los pacientes con NCC desde el primer nivel de atención de salud es sumamente relevante para poder tratarlos oportunamente. Sin embargo, no siempre, a este nivel, se cuentan con las tecnologías de imágenes disponibles y se requieren mas bien de otros métodos complementarios como las pruebas serologías. El presente estudio presente poder evaluar la utilidad de herramientas complementarias que apoyen el diagnóstico del paciente desde el primer de atención y escalables a otros niveles, es decir en el que se pueda hacer uso parámetros demográficos / clínicos y de pruebas serológicas cuantitativas que brinden información útil para discernir entre aquellos pacientes con NCC con o sin infección viable. Ayudando así a un diagnóstico oportuno para más pacientes, lo cual indirectamente incrementaría la equidad de salud respecto al acceso de un diagnóstico oportuno y el desarrollo de estrategias para mejora de la cobertura. 36 Específicamente, la presente investigación se centrará en un grupo importante de pacientes con NCC, aquellos con un patrón clase 2 quienes representan casi un tercio (27 %) del total de pacientes con NCC y en los que el diagnostico actual para determinar infección viable mediante serología es más complicado. Los pacientes con un patrón clase 2 tienen en la prueba serológica LLGP-EITB 2 o bandas positivas (GP50, GP42-39, GP 24). Tomado en cuenta lo descrito previamente, la presente tesis doctoral plantea estudiar la siguiente hipótesis general: “En pacientes con NCC que presentan un patrón de anticuerpos de clase 2 y que son una población heterogénea en función de la viabilidad del parásito, la presencia de cisticercos viables está relacionada a la distribución de anticuerpos detectados mediante LLGP-EITB; asimismo, el perfil cuantitativo de anticuerpos permite identificar con buena precisión la presencia de cisticercos viables”. Particularmente, en cada uno de los dos estudios de la tesis, se plantea evaluar las siguientes hipótesis de estudio: Estudio 1: En pacientes con NCC parenquimal con un patrón de anticuerpos clase 2 en LLGP-EITB, los pacientes que expresan tres bandas presentan una mayor frecuencia de infecciones viables que aquellos con combinaciones incluyendo solamente dos bandas. Asimismo, las variables demográficas permiten también orientar el diagnostico. Estudio 2: En pacientes con NCC con un patrón de anticuerpos clase 2 en LLGP- EITB, la medición cuantitativa de anticuerpos contra 3 glicoproteínas recombinantes/sintéticas representativas permite identificar con buena precisión (>90 % de sensibilidad y >95 % de especificidad) la presencia de cisticercos viables. 37 IV. INVESTIGACIÓN 1: PERFIL DE ANTICUERPOS EN LLGP-EITB Y VARIABLES DEMOGRÁFICAS PARA EL DIAGNÓSTICO DE INFECCIÓN VIABLE EN NEUROCISTICERCOSIS PARENQUIMAL EN PACIENTES CON UN PATRÓN DE ANTICUERPOS CLASE 2 4.1 Resumen La NCC es una de las principales enfermedades parasitarias del sistema nervioso central que contribuye de manera importante a la carga de trastornos convulsivos y epilepsia, principalmente en países de bajos recursos. Determinar infección viable en pacientes con NCC es fundamental para establecer el mejor manejo terapéutico. Las neuroimágenes son la principal herramienta para determinar infección viable; sin embargo, no siempre brindan un diagnóstico definitivo; por lo cual la prueba serológica LLGP-EITB puede ser una herramienta de ayuda para complementar el diagnóstico. Los patrones de bandas en LLGP-EITB (clase 1, 2, 3 o 4) permiten discernir entre infección viable o no viable a excepción en los pacientes con un patrón clase 2, quienes tienen la misma probabilidad de tener quistes viables o no viables (50 %). Los pacientes con un patrón clase 2 representan un cuarto de la población de pacientes con NCC (27 %) y pueden tener resultados imagenológicos no definitivos de viabilidad, por lo cual necesitan herramientas que apoyen su correcto diagnóstico. En ese sentido, la identificación de diferencias en la respuesta de anticuerpos (distribución de bandas, cuantificación de anticuerpos), evaluar factores como la edad y el sexo, reportados como determinantes en la respuesta de anticuerpos diferenciada en las infecciones parasitarias, entre quienes tienen quistes 38 viables y no viables, podrían ser útiles para el diagnóstico diferencial de estos pacientes. Objetivo. Evaluar la distribución de anticuerpos en LLGP-EITB, los niveles de anticuerpos contra glicoproteínas mediante MBA y las características demográficas para discriminar infección viable en pacientes con NCC con un patrón serológico clase 2. Materiales y Métodos. Evaluamos la distribución de bandas en LLGP-EITB, identificando 3 subgrupos (con dos o tres bandas positivas); la cuantificación de anticuerpos contra las glicoproteínas rGP50, rT24H, sTsRS1 y sTs18var1 mediante MBA; la edad, el sexo y la procedencia; así como la viabilidad mediante imágenes, en 944 pacientes con NCC, sintomáticos, de tipo parenquimal, con un patrón serológico clase 2, que acudieron al Instituto Nacional de Ciencias Neurológicas (INCN). Resultados. Sobre la distribución de bandas, se observó que aquellos con 3 bandas positivas (GP50, GP39-42 y GP24) tienen en mayor proporción quistes viables (39.5 % vs 25.6 %, p=0.002) y una mayor posibilidad (61 % más) de presentar quistes viables que aquellos con solo 2 bandas positivas. Sobre la cuantificación de anticuerpos contra glicoproteínas específicas de Taenia solium, la presencia de anticuerpos contra rT24H se asoció con una mayor frecuencia de quistes viables, indistintamente del tipo de distribución de bandas. El MBA-ratio establecido para rT24H fue 14.16 para todos los pacientes clase 2 evaluados, 23.94 para el subgrupo 1 (GP50+ y GP42-39+), 8.957 para el subgrupo 2 (GP42-39+ y GP24+) y 38.16 para el subgrupo 3 (GP50+, GP43-39+ y GP24+). En el total, el subgrupo 1, subgrupo 2 y subgrupo 3 tener un resultado positivo a rT24H se asoció a 2.81, 9.0, 5.0 y 2.46 veces más posibilidad de presentar quistes viables, que aquellos con resultado negativo, respectivamente. Por otro lado, tener resultados positivos contra sTs18 se asoció a una mayor probabilidad de tener 39 quistes viables en el total de pacientes evaluados (2.64 veces más, p= 0.005), pero no permitió ver diferencias a nivel de subgrupos (dos o tres bandas positivas en LLGP-EITB). Por su parte, la medición de anticuerpos contra sTs14, utilizando un punto de corte de 7.333 para el MBA-ratio permitió identificar al 100% de pacientes con quistes viables del subgrupo 1. La medición de anticuerpos contra rGP50 no permitió ver diferencias respecto a la viabilidad. El análisis de clases latentes identificó dos clases o grupos de pacientes en la población evaluada por MBA, se observó que las personas que tienden a expresar anticuerpos contra casi todas las glicoproteínas evaluadas (específicamente rGP50, rT24H y sTs18) tienen 5.4 veces mayor probabilidad de tener cisticercos viables que aquellos que no (OR:5.4, IC 95 %: 1.90 a 15.36, p=0.002). Finalmente, se observó diferencia estadísticamente significativa entre quienes tienen quistes viables y no viables según la edad (p =0.001) y el sexo (p=<0.001). Los pacientes del sexo masculino (47 % vs 29 %; razón de prevalencia [RP]=1.62) y de 40 años o menos (41 % vs 31 %; RP=1.35) tuvieron en mayor proporción quistes viables. No se observó diferencias en función del lugar de procedencia. Conclusión. Nuestros hallazgos sugieren que tener 3 bandas positivas, ser del sexo masculino y tener 40 años o menos son características que nos pueden ayudar a orientar el diagnostico hacia una infección viable en NCC. Asimismo, evaluar la concentración de anticuerpos contra rT24H puede ser de utilidad para orientar el diagnóstico hacia infección viable en pacientes con patrón serológico clase 2, incluso a nivel de subgrupos (pacientes con solo 2 o 3 bandas positivas en LLGP-EITB). La medición de anticuerpos contra sTs14 puede ser de utilidad específicamente para los pacientes con 2 bandas positivas en LLGP-EITB (GP50+ y GP42-39+); y contra sTs18 en pacientes con un patrón clase 2 en general. 40 La positividad de 3 o más glicoproteínas evaluadas por MBA se asocia fuertemente a tener infección viable. Son necesarios futuros estudios sobre la cuantificación de anticuerpos contra glicoproteínas de Taenia solium para confirmar estos hallazgos. Palabras clave: anticuerpos, glicoproteínas, serología, neurocisticercosis 41 4.2 Introducción La NCC es una de las principales enfermedades parasitarias del sistema nervioso central y es la causa prevenible de epilepsia más frecuente en países donde el parásito es endémico (13,115,116), como el Perú (117). Esta enfermedad es ocasionada por el estadio larval (cisticerco) de Taenia solium (110). La infección comienza por la ingesta de alimentos contaminados con huevos del parásito, de los cuales eclosionan las larvas que atraviesan la pared intestinal y viajan vía el torrente sanguíneo hasta el sistema nervioso central (NCC) u otros órganos (cisticercosis), estableciéndose en ellos como cisticerco o quistes (8). La identificación de cisticercos viables es fundamental para el diagnóstico (90,118), porque determina el manejo terapéutico del paciente (75). Cuando el parásito esta viable existe interacción hospedero-parásito de forma dinámica (3,47,48,60,113,119,120); por ello el tratamiento debe considerar los posibles eventos secundarios relacionados a la respuesta inflamatoria del huésped, provocada por la muerte del parásito, tales como cefalea, náuseas, vómitos, fiebre, hipertensión endocraneana, llegando incluso a convulsiones y coma (114). Por lo tanto, la identificación de pacientes con presencia de cisticercos viables es de suma importancia. Si bien el diagnóstico por imágenes mediante resonancia magnética (RM) y/o tomografía axial computarizada (TAC) permiten la visualización de las lesiones intracraneales de la NCC (90), no siempre brinda un diagnóstico definitivo de infección viable (90,111,112). En este escenario, las pruebas serológicas pueden brindar información complementaria para el diagnóstico. Dentro de las pruebas serológicas, el estándar de referencia es el ensayo de inmunoelectrotransferencia ligado a enzimas (EITB, por sus siglas en inglés) que utiliza glicoproteínas 42 purificadas unidas a lectina de lenteja (LLGP por sus siglas en inglés) (90,118). La prueba de LLGP-EITB detecta anticuerpos contra glicoproteínas específicas de Taenia solium, expresándose de 1 a 7 bandas (GP50, GP42-39, GP24, GP21, GP18, GP14 y GP13)(73). Las glicoproteínas, que son utilizadas en LLGP-EITB, se encuentran estructuralmente ubicadas en la superficie del cisticerco (tegumento) en lo que se denomina la glicocálix que cubre las microtrichas del parásito y estimulan la respuesta inmune (69). Estas son purificadas de los extractos solubles de cisticercos de t. solium y en EITB se distribuyen en 7 bandas según sus pesos moleculares (73). Todas ellas, pertenecen a tres grandes familias de glicoproteínas, la familia GP50, la familia 42/24 y la familia 8kDa (Figura 1)(121). La GP50 es una glicoproteína de membrana anclada a glicosilfosfatidilinositol y su forma nativa migra a 50 kDa(80). Una evaluación preliminar de la sensibilidad de la GP50 recombinante en un ensayo de Western blot (WB) muestra que tiene una sensibilidad del 90 % para detectar muestras de suero de infección por cisticercosis que son reactivas con el componente GP50 de LLGP (80). Las glicoproteínas de la banda GP42-39 y GP24 son los antígenos más frecuentemente reconocidos por muestras de pacientes con cisticercosis procedentes de zonas de alto riesgo(73,79). Luego de purificar y caracterizar estos antígenos, se determinó la homología entre GP42-39 y GP24, dado que tenían una misma composición de aminoácidos y secuencia amino terminal (idéntica en 22 residuos evaluados) (122). Sin embargo, estas dos glicoproteínas fueron diferentes en la proporción de azúcares detectados. Se cree que esto se debe al polimorfismo en la estructura de los glicanos o al proceso postraduccional. Además se identificó una subunidad de 10 kDa al reducir GP42- 43 39 y GP24 (122). Se ha descrito que las proteínas de 8 kDa pueden estar presentes no solo en las bandas GP21, GP18, GP14 y GP13, sino también en las bandas GP42- 39 y GP24 (79,122). Esto es importante dado que los pacientes con presencia de cisticercos viables frecuentemente expresan anticuerpos contra las glicoproteínas de la familia 8 kDa (93). Se ha descrito que los pacientes con NCC pueden presentar diferentes patrones de bandas positivas mediante la prueba de LLGP-EITB, clasificándolos en 4 tipos: i) patrón clase 1, con ninguna banda positiva o solo GP50 positiva; ii) patrón clase 2, con las bandas GP42-39 y GP24 positivas o las bandas GP50 y GP42-39 positivas o las bandas GP50, GP42-39 y GP 24 positivas; iii) patrón clase 3, con las bandas GP50, GP42-39, GP24 y GP13 positivas o las bandas GP50, GP42-39, GP24, GP14 y GP13 positivas); y iv) patrón clase 4, con las bandas GP50, GP42-39, GP24, GP21, GP14 y GP13 positivas o las bandas GP50, GP42-39, GP24, GP21 y GP18 positivas] o las bandas GP50, GP42-39, GP24, GP21, GP18 y GP14 positivas o las bandas GP50, GP42-39, GP24, GP21, GP18, GP14 y GP13 positivas (93). Estos patrones están asociados con una frecuencia de cisticercos viables alta (patrón clase 3 y 4), o menor (patrón clase 1)(93), lo cual puede ser útil para orientar el diagnóstico hacia la presencia parásitos viables. No obstante, los pacientes con un patrón clase 2, tienen similar probabilidad de tener o no cisticercos viables (93). Por lo tanto, son necesarias otras evaluaciones que permitan discernir entre aquellos con infección viable y no viable en este grupo de pacientes. Los pacientes con un patrón clase 2, representan aproximadamente un cuarto (27 %) de la población de pacientes con NCC (93). Respecto a sus características serológicas cualitativas (distribución de bandas positivas en LLGP-EITB), están 44 conformados por 3 subgrupos, i) subgrupo 1: banda GP42-39 y GP24, ii) subgrupo 2: banda GP50 y GP42-39 y iii) subgrupo 3: banda GP50, GP42-39 y GP24. La banda GP42-39 positiva es común a todos los subgrupos, mientras que las bandas GP50 positiva y GP24 positiva son las que diferencia a los tres subgrupos. Por otro lado, no se ha descrito que la combinaciones de bandas GP50 y GP24 positivas sea parte del patrón clase 2 (93). Por lo descrito, existen diferentes expresiones de anticuerpos (distribución de bandas positivas) en este grupo de pacientes, cuya relación con la viabilidad de la infección aún no ha sido estudiada. Por otro lado, a nivel cuantitativo existes glicoproteínas que pueden ser útiles para la evaluación de anticuerpos en pacientes con NCC. Actualmente se encuentran disponibles glicoproteínas recombinantes o sintéticas de Taenia solium. Estas glicoproteínas son representativas de las familias de glicoproteínas GP50, T24/42 y/o 8kDa. Se han caracterizado y clonado las glicoproteínas GP50 y T24. La proteína recombinante de GP50 (rGp50), antigénicamente activa, expresada en el sistema de baculovirus, tiene un peso molecular de 29 kDa (80). T24 es una proteína integral de membrana que pertenece a la superfamilia de tetraspanina, migra en 24 kDa y una porción de T24, el dominio de bucle extracelular grande, se expresó en células de Echerichia coli, denominándose rT24H (83). Así también, se ha sintetizado químicamente las proteínas de la familia de 8 kDa. Hancock et al señalan que estas proteínas son secretadas por el parásito viable, lo cual estaría en concordancia con que la mayoría de pacientes que expresan anticuerpos contra las proteínas de 8 kDa en LLGP-EITB presentan cisticercos viables en más del 80 % (93) Estas proteínas presentan 4 clados (ramas) (Ts18, Ts14, TsRS1 y TsR2), de los cuales se han sintetizado 9 (Ts18, Ts18var1, Ts18var3, Ts18var4, Ts18var6, 45 Ts18var8, TsR1, TsRS1, Ts14)(79). Sin embargo las más representativas de esta familia y que han mostrado una mejor sensibilidad y especificidad para infecciones múltiples o de un solo parásito en pacientes con NCC fueron: Ts14, Ts18var1(123– 127) y TsR1(77,124). La metodología multiplex bead-based assay (MBA) es la metodología de elección para la medición de anticuerpos utilizando proteínas recombinantes o sintéticas dado que se ha reportado que puede ser más sensible para detectar anticuerpos, incluso en pacientes con baja carga parasitaria (1 cisticerco viable), que otras metodólogas como el ELISA, WB, Multiantigen print, las cuales no logran mejorar su sensibilidad para detectar infecciones únicas (77,125), como si sucede con MBA (126). Asimismo, se señala que la sensibilidad para detectar casos de pacientes con NCC con un cisticerco viable es del 92 % con MBA utilizando los antígenos recombinantes/sintéticos sTs18var1, rGP50, y rT24H (126). Es importante mencionar que esta sensibilidad se estimó en pacientes con NCC en general, no específicamente en aquellos con un patrón de anticuerpos clase 2. Los pacientes con un patrón de anticuerpos clase 2, presentan anticuerpos contra las bandas antigénicas de glicoproteínas GP50, GP42-39 y/o GP24 en LLGP-EITB (93); por lo que sería de interés evaluar cuantitativamente estos anticuerpos contra las proteínas recombinantes rGP50, y rT24H. Tomando en cuenta que los antígenos de la familia 8 kDa pueden estar presentes también en las bandas de antígenos GP 42-39 y/o GP24 (118) se consideró importante evaluar anticuerpos contra glicoproteínas de la familia de 8 kDa, tales como Ts14 y Ts18. 46 Por otro lado, la edad y el sexo juegan un rol importante, tanto en aspectos inmunológicos como en la interacción hospedero-parásito (113,128–132), y la procedencia del paciente puede estar relacionada con el grado de exposición al parásito, dependiendo si este procede de una zona endémica o no de teniasis/cisticercosis. En ese sentido, la evaluación de estas variables podría servir para explorar su asociación con la viabilidad del parásito en pacientes con un patrón de anticuerpos clase 2 en LLGP-EITB. El objetivo de este estudio fue evaluar la capacidad de la distribución de las bandas en LLGP-EITB y las características demográficas para discriminar infección viable en pacientes con NCC parenquimal con un patrón serológico clase 2; asimismo se explorar los niveles de anticuerpos contra glicoproteínas mediante MBA según la distribución de bandas. 4.3 Materiales y métodos 4.3.1. Diseño de estudio y participantes Este estudio es de tipo transversal analítico. Se incluyeron pacientes sintomáticos que acudieron a la Unidad de Cisticercosis del Instituto Nacional de Ciencias Neurológicas (INCN) de Lima para su diagnóstico inicial de NCC bajo la sospecha de tener esta infección debido a la presencia de síntomas compatibles con NCC como convulsiones, dolor de cabeza crónico, entre otros durante el período 1996 a 2017. Los pacientes fueron inicialmente elegibles si tuvieron un patrón de anticuerpos clase 2 en la evaluación serológica inicial con LLGP-EITB. Asimismo, si tuvieron 47 una RM y TAC tomadas en un período de tiempo no mayor de 3 meses antes o después de su primera muestra de suero con la finalidad de evitar un efecto de sesgo en la evolución de la enfermedad entre los resultados de neuroimágenes y la serología. Los pacientes fueron posteriormente incluidos en el estudio si sus neuroimágenes presentaron lesiones compatibles con NCC parenquimal luego de la revisión por neurólogos de la Unidad de Cisticercosis. Se incluyeron todos los tipos de resultados de NCC parenquimal, tales como: cisticercos viables (lesiones redondeadas pequeñas alrededor de 10 milímetros de diámetro, llenas de contenido en su interior de señal hiperintensa en secuencias T2 de RM, con o sin edema periquístico y en algunos casos con un nódulo interno correspondiente al escólex invaginado), o calcificaciones residuales (lesiones nodulares pequeñas con señal hiperdensa en la TAC, con o sin edema perilesional, Figura 2B), cisticercos en fase degenerativa (lesiones nodulares con ausencia de señal de contenido líquido en la RM y marcada reacción inflamatoria periquística). También se incluyeron a pacientes cuyas neuroimágenes fueron consideradas negativas durante la revisión. Se excluyeron pacientes con lesiones compatibles con NCC extraparenquimal (cisticercos subaracnoideos y/o ventriculares) debido a que se espera que todos estos cisticercos sean viables. Todos los pacientes contaron con datos demográficos, datos de los hallazgos de neuroimágenes (TAC y RM) y resultados de LLGP-EITB descritos en la base de datos de la Unidad de Cisticercosis de INCN. Una vez identificado a la población de estudio (n=994), se seleccionaron a 99 pacientes para la evaluación cuantitativa de anticuerpos mediante MBA. Estos 99 pacientes estuvieron conformados por 33 48 pacientes de cada tipo de distribución de bandas; es decir 33 pacientes del subgrupo 1 (GP50 y GP42-39 positivas) (estos 33 correspondieron al total de este subgrupo), 33 pacientes del subgrupo 2 (GP39-42 y GP24 positivas) y 33 pacientes con 3 bandas positivas. Los pacientes evaluados por MBA fueron seleccionados al azar considerando que cada subgrupo tuviera características similares en función de la edad y el sexo. Estos resultados fueron utilizados para hacer el análisis comparativo del perfil de anticuerpos cuantitativo y la viabilidad del parásito determinada por neuroimágenes. 4.3.2 Procedimientos de estudio 4.3.2.1 Muestras Los pacientes que acuden por primera vez a la Unidad de Cisticercosis del INCN son evaluados clínica y serológicamente (LLGP-EITB). Para dicha evaluación serológica se extrae una muestra de sangre (9ml) en tubo sin anticoagulante a fin de separar el suero por centrifugación (15 minutos a 3500 rpm) y ser almacenado a - 20° hasta su procesamiento. En el presente estudio, para la evaluación de anticuerpos por MBA, se utilizaron los sueros de los pacientes que brindaron su consentimiento informado para uso posterior de dichas muestras y cumplieron con los criterios de inclusión. 4.3.2.2 Cuantificación de anticuerpos mediante MBA Se emplearon 4 antígenos, 2 recombinantes: rGP50, rT24H y 2 sintéticos: sTs14 y sTs18, acoplados a unas perlas magnéticas o beads. El método fue estandarizado en 49 el Laboratorio de Neurocisticercosis – LID 115, que pertenece a los Laboratorios de Investigación y Desarrollo (LID) de la Universidad Peruana Cayetano Heredia (UPCH). Brevemente, el procedimiento consistió en diluir la muestra de suero 1:100 en PBS Tween 0.3% Leche 5%. A una microplaca de inmunoensayos de color oscuro para proteger a los beads de la luz, se le adicionó 50 ul de la muestra de suero previamente diluida y 50 ul de la solución con los beads magnéticos acoplados, se incubó por 30 minutos en movimiento constante a temperatura ambiente. Posterior a ello, se realizaron 4 lavados con PBS Tween 0.3% y se adicionó 50 ul de conjugado (anti human IgG con biotina diluido 1:200 en PBS Tween 0.3% Leche 5%) e incubó por 30 minutos. Transcurrido el tiempo, se adicionó 50 ul de Estreptavidina-Ficoeritrina diluido 1:250 en PBS Tween 0.3% Leche 5% y se incubó por otros 30 minutos. Finalmente se lavó con PBS Tween 0.3%. Los beads se suspendieron en 125 ul de PBS BSA 1% Azida de sodio 0.05% y se leyó en el equipo MagPix (Luminex corp.TM). El resultado fue la intensidad de fluorescencia media (MFI, por sus siglas en inglés). El MFI obtenido para cada muestra y antígeno en MBA se transformó en un ratio serológico (MBA-ratio) de la siguiente manera(133) : MBA-ratio = MFI muestra (Promedio de MFI control negativo*) x 3 DS control negativo *Sueros de 8 voluntarios sanos, sin exposición ni sospecha de NCC, teniasis u otras parasitosis relacionadas DS: Desviación estándar 50 Asimismo, además de los sueros de los pacientes (Tabla 3), se utilizaron controles negativos (pool de sueros negativos de pacientes sanos) y sueros positivos a fin de garantizar la repetibilidad inter e intra test MBA. IV.3.2.3. Determinación cualitativa de anticuerpos mediante la prueba de Lentil Lectin-bound Glycoproteins - Enzyme-linked Immunoelectro Transfer Blot (LLGP-EITB) Se realizó el ensayo de LLGP-EITB siguiendo la metodología previamente descrita por Tsang et al (73). La lectura de los resultados (identificación de las bandas positivas) fue realizada por un técnico de laboratorio y posteriormente confirmadas por el supervisor de laboratorio. Los resultados de LLGP- EITB fueron reportados como número de bandas (0 a 7). Se seleccionaron aquellos pacientes con un patrón de bandas clase 2, según lo reportado por Arroyo et al (93). Es decir, aquellos con 2 o 3 bandas positivas a GP50, GP43-39 y/o GP24. 4.3.2.4 Determinación de la viabilidad (Neuroimágenes) La viabilidad del parásito (cisticerco ubicado en el parénquima cerebral) se determinó en función de los resultados de imágenes de la TAC y RM. Un parásito viable (o cisticerco viable) fue definido como aquel que conserva su estructura (membrana, liquido vesicular y escólex), se observa de forma oval, con presencia de líquido en el interior y el escólex (48). Las lecturas de neuroimágenes fueron realizadas por un radiólogo independiente. Estos resultados fueron posteriormente confirmados por un segundo neurólogo del 51 grupo de investigación. A partir de las lecturas de neuroimágenes los casos fueron clasificados como con NCC viable (al menos un cisticerco viable, independientemente de la presencia o ausencia de calcificaciones o granulomas) o con NCC no viable (únicamente presencia de lesiones calcificadas con o sin granulomas). 4.3.3 Análisis estadístico Los resultados de la distribución de bandas, el nivel cuantitativo de anticuerpos (MBA), la información demográfica y los resultados de viabilidad por neuroimágenes fueron presentados mediante estadísticos descriptivos. Se evaluó la asociación entre la distribución de bandas en LLGP-EITB y la viabilidad a través un análisis de regresión bivariado y múltiple utilizando modelos lineales generalizables (GLM, por sus siglas en inglés), empleando con una distribución de distribución binomial y una función de enlace “log” para estimar razones de prevalencia crudas (RP) y ajustadas (RPa) por edad, sexo, procedencia y número de quistes. Por otra parte, para evaluar el rendimiento de detección de anticuerpos contra rGP50, rT24H, sTs14 y sTs18 para discernir entre infección viable y no viable, se establecieron puntos de corte (cut-off) de los valores MBA-ratio para cada antígeno. Los valores del MBA-ratio se utilizaron para construir curvas de características operativas del receptor (ROC) para determinar los valores de corte, la sensibilidad y la especificidad para cada antígeno en el MBA. Posterior a ello se determinó la proporción de pacientes con un resultado positivo (igual o mayor al cutt-off establecido) o negativo (menor al cut-off establecido) para cada antígeno en 52 evaluación. Se comparó el desempeño de cada antígeno para detectar pacientes con quistes viables. Esta comparación se realizó en el total de pacientes evaluados (n=94) y por subgrupos según la distribución de bandas en LLGP-EITB, empleando un análisis de regresión bivariado y múltiple utilizando modelos lineales generalizables (GLM, por sus siglas en inglés), empleando con una distribución de distribución binomial y una función de enlace “log” para estimar razones de prevalencia crudas (RP). De manera exploratoria se evaluó el perfil de anticuerpos contra los antígenos recombinantes/sintéticos de manera conjunta, mediante un análisis de clases latentes (ACL) para poder identificar y describir grupos no observados (clases latentes) en base de los datos de las variables observadas (resultados de cada glicoproteína-MBA). Posteriormente se evaluó la relación entre cada una de las clases latentes identificadas y la probabilidad de tener NCC viable, mediante un análisis de regresión logística. Finalmente, se evaluó la relación entre la edad, el sexo del paciente con el estado de viabilidad del parásito a través de modelos de regresión logística La significación estadística se fijó en p<0.05. Los datos se analizaron con STATA (Versión 17) y EPIDAT (Versión 3.1). 4.3.4 Consideraciones éticas Cada uno de los procedimientos descritos en el presente estudio han sido previamente revisados y aprobados por el Comité Institucional de Ética de la Universidad Peruana Cayetano Heredia (número de aprobación 554-48-22). En el presente estudio se utilizó información anónima de los pacientes que previamente firmaron un consentimiento informado autorizando el uso de sus sueros y/o de la información. 53 4.4 Resultados Entre 1996 a 2017, acudieron a la Unidad de Cisticercosis del INCN para el diagnóstico inicial de NCC un total de 1006 pacientes sintomáticos que presentaron un patrón de anticuerpos clase 2. De ellos 944 cumplieron con los criterios de elegibilidad. Los 62 pacientes excluidos presentaron NCC extraparenquimal. Las características de los pacientes incluidos en el estudio son presentadas en la Tabla 1. Los 944 pacientes incluidos comprendieron niños y adultos con una mediana de edad de 32.7 años (rango: 3-98). La mayor parte (65.7 %) fueron pacientes de 40 años o menos. La proporción entre hombres y mujeres fue similar en la población de estudio. En mayor porcentaje procedieron de zonas endémicas (66.1 %); es decir de cualquier departamento del Perú excepto Lima, Loreto, Madre de Dios, Tacna, Moquegua e Ica. Respecto a la distribución de bandas en LLGP-EITB, el 86.3 % presentó 3 bandas positivas (GP50, GP39-42 y GP24), el 10.2 % presento dos bandas positivas de tipo GP39-42 y GP24 y el 3.5 % presentó dos bandas positivas de tipo GP 50 y GP39- 42. Por otra parte, el 74.3 % presentó un resultado positivo en neuroimágenes evaluado por TAC y RM. Sobre la viabilidad del parásito, el 37.6 % (355 de 944 pacientes) de la población de estudio presentó al menos 1 quiste parenquimal viable (Tabla 1). De estos pacientes con infección viable, el 50.7 % pr