UNIVERSIDAD PERUANA CAYETANO HEREDIA FACULTAD DE CIENCIAS Y FILOSOFÍA “ALBERTO CAZORLA TALLERI” MECANISMOS DE RESISTENCIA A PENICILINA EN CEPAS CLÍNICAS DE Streptococcus pneumoniae Tesis para optar el Título Profesional de Licenciada en Biología Autor: Mirtha Elizabeth Diaz Melgar Asesora: Dra. Theresa Ochoa Woodell Co-Asesor: MSc (c) Erik Mercado Zarate Lima-Perú 2022 ÍNDICE N° Pág. Resumen…………………………….….…….………..….…………..……..………......1 Abstract…….…………..……………..……………………..……...………….………..2 I. Introducción ............................................................................................................... 3 I.1 Streptococcus pneumoniae ................................................................................. 3 I.1.1 Clasificación taxonómica: ................................................................................. 3 I.1.2 Características ................................................................................................... 4 I.1.3 Infecciones ........................................................................................................ 4 I.1.4 Epidemiologia de enfermedades neumocócicas ................................................ 4 I.2 Penicilina ............................................................................................................ 5 I.2.1 Importancia ....................................................................................................... 5 I.2.2 Desarrollo de la resistencia a penicilina ............................................................ 6 I.2.3 Determinación de la resistencia antimicrobiana................................................ 6 1.2.4 Mecanismos moleculares de resistencia a penicilina G ................................... 8 I.3 Serotipos y resistencia antibiótica .................................................................... 11 II. Justificación del estudio .......................................................................................... 11 III. Pregunta de investigación ........................................................................................ 12 IV. Objetivos .............................................................................................................. 12 IV.1 Objetivo general ................................................................................................. 12 IV.2 Objetivos específicos ......................................................................................... 13 V. Materiales y métodos ............................................................................................... 13 V.1 Población y muestra ............................................................................................. 13 V.1.1 Población para el primer estudio ................................................................... 13 V.1.2 Población para el segundo estudio ................................................................. 15 VI.2 Extracción de DNA de cepas de S. pneumoniae ................................................. 16 V.3 Estandarización de sistemas de PCR convencional ............................................. 16 V.3.1 Elección de cebadores ................................................................................... 16 V.3.3 Amplificación del ADN ................................................................................. 17 V.3.4 Electroforesis en gel de agarosa .................................................................... 17 V.4 Análisis estadístico ............................................................................................... 18 VI. Resultados ............................................................................................................ 18 VI.1 Estandarización de PCR multiplex ..................................................................... 18 VI.2 Alteraciones de los genes pbps y murM en cepas invasivas y colonizadoras .... 19 VI.3 Correlación de la susceptibilidad antimicrobial y resultado de PCR. ................ 21 VI.4 Asociación entre la presencia de alteraciones y la resistencia a penicilina G ... 24 VII. Discusión ............................................................................................................. 25 VIII. Conclusiones ........................................................................................................ 31 IX. Recomendaciones…………………………………………………………..…...31 X. Referencias bibliográficas .................................................................................... 31 LISTA DE FIGURAS Figura 1. Estructura química de penicilina G…………………………………………...5 Figura 2. Porcentaje de resistencia a penicilina de cepas de Streptococcus pneumoniae en los últimos años en Lima……………………………………………………….…….6 Figura 3. Representación esquemática del mecanismo de acción de penicilina…….….9 Figura 4. Mutaciones en mosaico de genes pbp2x de aislados clínicos………………10 Figura 5. Amplificación de genes de resistencia mediante electroforesis en gel de agarosa……………………………………………………………………………….…19 Figura 6. MIC de penicilina G según los genotipos identificados por PCR convencional en cepas invasivas de S. pneumoniae…………………………….…...………….……22 Figura 7. MIC de penicilina G según los genotipos identificados por PCR convencional en cepas colonizadoras de. S. pneumoniae………………………………..….………..23 Figura 8. Valores de MIC (µg/ml) según el número de alteraciones en pbps y MurM alterados…….…..……...……………………………………………………………….25 LISTA DE TABLAS Tabla 1. Puntos de corte para penicilina………………………………………………...7 Tabla 2. Cebadores usados para la amplificación de los genes de resistencia y lytA….16 Tabla 3. Frecuencia de genes pbp2x, pbp2b, pbp1a y murM alterados……………….20 Tabla 4. Número de genes pbp2x, pbp2b, pbp1a y murM alterados…...……………...20 Tabla 5. Genotipos alterados en cepas invasivas y colonizadoras. …………………....21 Tabla 6. Mediana de MIC de penicilina G según este alterados o no alterado el gen...................................................................................................................................21 Tabla 7. Asociación entre el número de genes alterados y la resistencia según los puntos de corte para cepas meníngeas y no meníngeas……………………………………………………………………………....24 1 RESUMEN Introducción: Streptococcus pneumoniae es el responsable de la mayoría de casos de neumonía, bacteremia y meningitis a nivel mundial. La penicilina ha sido el principal antibiótico para el tratamiento de enfermedades neumocócicas por mucho tiempo; sin embargo, las cepas resistentes han ido aumentando en los últimos años en el Perú. La resistencia ha sido atribuida a mutaciones en los genes pbps2x, 2b, 1a y murM. Objetivo: Determinar los mecanismos de resistencia a penicilina en cepas de S. pneumoniae aislados de niños con enfermedad neumocócica invasiva y niños portadores sanos de Lima a través del estudio de los genes pbp2x, pbp2b, pbp1a y murM. Métodos: Se analizaron 60 cepas aisladas de niños menores de 14 años con enfermedad neumocócica invasiva y 136 cepas de muestras nasofaríngeas provenientes de niños portadores menores de dos años en Lima entre 2016 y 2019. Todas las cepas eran no- sensibles a penicilina por el disco de oxacilina. La susceptibilidad antimicrobial a penicilina G fue determinada por la concentración mínima inhibitoria. Se determinó la presencia de genes pbps y murM alterados mediante dos sistemas de reacción en cadena de la polimerasa convencional estandarizados en este estudio. Resultados: La presencia del gen pbp2x alterado fue hallada en 96.7% (58/60), pbp2b en 70.0% (42/60), pbp1a en 85.0% (51/60) y murM en 5.0% (3/60) cepas invasivas. En cepas portadoras por otra parte, pbp2x estuvo alterado en 93,4% (127/136), pbp2b en 88.2% (120/136), pbp1a en 59.6% (81/136) y murM en 13.2% (18/136). El genotipo alterado más frecuente fue pbp1a, pbp2b y pbp2x. Hubo una correlación positiva entre el número de genes alterados y los valores de MIC en cepas invasivas y colonizadoras respectivamente. Asimismo hubo asociación entre el número de genes alterados y la resistencia cuando se emplea puntos de corte para cepas meníngeas. Conclusiones: Hubo asociación entre la presencia de genes alterados y la resistencia a penicilina cuando se emplea puntos de corte para cepas meníngeas. Además, las cepas con un mayor número de genes alterados presentaron mayor valor de MIC. Palabras clave: resistencia antimicrobiana, penicilina G, Streptococcus pneumoniae, pbp2x, pbp2b, pbp1a, murM. 2 ABSTRACT Background: Streptococcus pneumoniae is responsible for the majority of cases of pneumonia, bacteremia and meningitis worldwide. Penicillin has been the main antibiotic for treating pneumococcal diseases for a long time; however, resistant strains have been increasing in recent years in Peru. Penicillin resistance in clinical strains has been attributed to mutations in the pbps2x, 2b, 1a genes and murM. Objective: Determine the mechanisms of resistance to penicillin in strains of S. pneumoniae isolated from children with invasive pneumococcal infection and healthy carrier children from Lima by studying the pbp2x, pbp2b, pbp1a and murM genes. Methods: We analyzed 60 isolates from children under 14 years with invasive pneumococcal disease (IPD) and 136 strains of nasopharyngeal carriers younger than 2 years in Lima between 2016 and 2019. All the strains were not sensitive to penicillin due to the oxacillin disk. Antimicrobial susceptibility to penicillin was determined by Minimum Inhibitory Concentrations (MIC). Detection of pbps and murM mutations was determined using two multiplex Polymerase Chain Reaction (PCR) systems standardized in this study. Results: The presence of the altered pbp2x gene was found in 96.7% (58/60), pbp2b in 70.0% (42/60), pbp1a in 85.0% (51/60) and murM in 5.0% (3/60) invasive strains. In carrier strains, on the other hand, pbp2x was altered in 93.4% (127/136), pbp2b in 88.2% (120/136), pbp1a in 59.6% (81/136) and murM in 13.2% (18/136). The most frequent altered genotype was pbp1a, pbp2b and pbp2x. There was a positive correlation between the number of altered genes and the MIC values in invasive and colonizing strains respectively. There was also an association between the number of genes mutated and altered for resistance when cut-off points for meningeal strains were used. Conclusions: There was an association between the presence of altered genes and resistance to penicillin when cut-off points for meningeal strains are used. In addition, the strains with a greater number of alterated genes presented a higher MIC value. Keywords: antimicrobial resistance, penicillin G, Streptococcus pneumoniae, pbp2x, pbp2b, pbp1a, murM. 3 I. Introducción Streptococcus pneumoniae es el responsable de la mayoría de casos de neumonía y meningitis a nivel mundial en niños (1). Las penicilinas son las drogas de elección para el tratamiento de enfermedades neumocócicas (2); sin embargo, las cepas resistentes han ido aumentando en los últimos años en el Perú y en el resto del mundo (3). Las penicilinas, igual que otros antibióticos betalactámicos, inhiben el crecimiento bacteriano mediante la inactivación de las proteínas de unión a penicilina (PBPs, por sus siglas en inglés Penicillin Binding Proteins). Las PBPs son enzimas que catalizan los últimos pasos de la formación del peptidoglicano, el cual es el componente principal de la pared celular. Estas han sido clasificadas según la similitud de su secuencia. Neumococo presenta seis clases de PBPs: PBP1a, PBP1b, PBP2a, PBP2x, PBP2b y PBP3 (4). La resistencia a penicilina G en cepas clínicas se ha atribuido principalmente a mutaciones en los genes pbps2x, 2b y 1a. Además, algunos estudios señalan que están involucradas mutaciones en otros genes, entre los que destaca murM (5-7). Dicho gen codifica una enzima que cataliza una reacción clave durante la formación del peptidoglicano (8). En la presente tesis se determinó la asociación entre la presencia de los genes pbp2x, 2b, 1a y murM alterados y la resistencia en cepas invasivas y colonizadoras de neumococo aislados de niños. I.1 Streptococcus pneumoniae I.1.1 Clasificación taxonómica: Dominio: Bacteria Phylum: Firmicutes Clase: Bacilli Orden: Lactobacillales Familia: Streptococcaceae Género: Streptococcus 4 Especie: Streptococcus pneumoniae (9) I.1.2 Características S. pneumoniae, comúnmente llamado neumococo, es una bacteria Gram positiva, con forma ovalada o de lanceta cuyo tamaño varía entre 0.5-1.25 μm. Se presenta en pares (diplococos) o en cadenas cortas. No forma endosporas ni posee flagelos por lo que no tiene movilidad (10). Además, es un microorganismo quimiorganotrofo, anaerobio facultativo, catalasa negativa y realiza fermentación homoláctica. Las pruebas convencionales para su identificación en el laboratorio son: la morfología de las colonias en agar sangre (en este se observarán pequeñas, grisáceas, acuosas y rodeadas de una zona verdosa de α- hemólisis), la tinción Gram, la prueba de susceptibilidad a optoquina y la prueba de solubilidad en bilis (11). Asimismo, neumococo posee una cápsula polisacárida, la cual es su principal factor de virulencia que le protege de la fagocitosis y genera una respuesta inmunológica específica (12). Las cepas de S. pneumoniae son categorizadas en serotipos basados en la estructura de sus cápsulas, de las cuales se han descrito 98 clases (13). I.1.3 Infecciones Streptococcus pneumoniae es una bacteria comensal que coloniza la zona nasofaríngea del ser humano (14), principalmente durante los dos primeros años de vida (15). Sin embargo, puede evadir la barrera inmunológica del huésped y causar diversas enfermedades desde sinusitis, otitis media y bronquitis hasta mucho más graves como bacteremia, meningitis y neumonía. Estas últimas son denominadas enfermedades neumocócicas invasivas (ENI) dado que son producidas cuando las cepas infectan fluidos estériles como la sangre, líquido cefalorraquídeo, líquido sinovial y líquido peritoneal (16). Asimismo, las infecciones neumocócicas están asociadas a un limitado número de serotipos (17). I.1.4 Epidemiologia de enfermedades neumocócicas Las enfermedades neumocócicas son las principales contribuyentes a la morbilidad y mortalidad en todo el mundo, aunque las tasas más altas de hospitalización y muerte son registradas en los países en desarrollo. Personas en alto riesgo incluyen niños, adultos mayores de 65 años e inmunosuprimidos. Se estima que neumococo causó 8,9 millones 5 de casos de neumonía, 84 mil casos de meningitis y 300 mil muertes en niños menores de cinco años a nivel mundial en el 2015 (1,18). En el Perú, S. pneumoniae es el patógeno responsable del mayor número de casos de neumonía y meningoencefalitis en niños (19). I.2 Penicilina I.2.1 Importancia Las penicilinas son un grupo de diferentes moléculas que se caracterizan por tener un anillo betalactámico de cuatro miembros nitrogenados en el centro de su estructura, denominado núcleo y la misma actividad antibacterial de bencilpenicilina (penicilina G) – la molécula original extraída de P. notatum. Estos antibióticos se distinguen por las cadenas laterales unidas a sus núcleos (Figura 1) y pueden ser naturales o semisintéticas (20). Figura 1. Estructura química de penicilina G (clase bencilpenicilina, 1 era generación). El anillo betalactámico, característica común de todas las clases de penicilinas está resaltado en marrón y la cadena sustituta está en color azul, Extraído de Lobanovska y Pilla (2017) (20). Estas penicilinas han sido el principal medio de tratamiento a infecciones neumocócicas durante décadas debido a su excelente actividad bactericida a bajas concentraciones. Además, tienen buena distribución y escasa toxicidad (21). Los primeros antibióticos como la penicilina G, V y benzatínica, a pesar de tener más de 60 años de uso, son de elección para el tratamiento vía parenteral de meningitis y neumonía comunitaria del adulto por neumococo en el Perú. La amoxicilina, una penicilina semisintética de tercera generación, es usada vía oral en casos de neumonía adquirida en la comunidad (2,22). 6 I.2.2 Desarrollo de la resistencia a penicilina La primera detección de cepas de neumococo resistentes a penicilina ocurrió en 1967 en Australia (23) y desde 1980 se han incrementado dramáticamente en todo el mundo (24). Actualmente, se estima que 50% de aislados son resistentes en Latinoamérica, con los más altos porcentajes en México (84.8%) y Venezuela (81.2%) (25). En el Perú, estudios en niños portadores sanos de Lima reportaron 5% de cepas resistentes en 1997 (26); 15 % en el 2000 (27) y 20% en el 2001 (28); 36 y 37% en el 2003 y 2004, respectivamente (28,29); 47% en el 2008 (30) y 57.4% en 2009 (31). Asimismo, se reportó 27% de resistencia a penicilina en el 2000 (32); 46% en el 2008 (33) y 50% en el 2011 (34) en cepas aisladas de niños con enfermedad neumocócica invasiva (Figura 2). Estos dos últimos datos obtenidos específicamente en cepas meníngeas. Figura 2. Porcentaje de resistencia a penicilina de cepas de S. pneumoniae en los últimos años en Lima. Las barras azules señalan cepas aisladas de niños portadores menores de tres años. Las barras rojas cepas invasivas obtenidas de niños menores de dieciséis años. Esta gráfica fue elaborada a partir de los datos obtenidos de diferentes estudios (26-34). I.2.3 Métodos para la determinación de la resistencia antimicrobiana La prueba de difusión de disco con 1μg de oxacilina (ODD por sus siglas en inglés, oxacillin disk diffusion) es un método eficaz y comúnmente utilizado en los laboratorios 5 27 15 20 37 46 47 57 50 0 10 20 30 40 50 60 70 1997 1999 2000 2001 2003 2008 2008 2009 2011 % 7 para la detección de neumococos no sensibles a penicilina. Los puntos de corte establecen que aislados con zonas de inhibición ≥20 mm son sensibles y aislados con zonas ≤ 19 mm son no sensibles. En el segundo caso, el Instituto de Normas Clínicas y de Laboratorio (CLSI por sus siglas en inglés, Clinical and Laboratory Standards Institute) recomienda determinar la Concentración Mínima Inhibitoria ya sea mediante el método de microdilución o el método de difusión con tiras de E-test, debido a que dichas zonas pueden ser relacionadas no solo resistencia o intermedio sino incluso susceptibilidad. Es decir, pueden haber casos de cepas que tengan zonas de inhibición igual a 10 mm clasificándolas como no sensibles pero al realizar la determinación del MIC podrían resultar ser sensibles (35). Respecto a la determinación del MIC, en enero de 2008, después de una reevaluación que incluyó estudios clínicos más recientes, el CLSI publicó nuevos puntos de corte de S. pneumoniae para la penicilina distinguiendo cepas de pacientes con o sin meningitis (Tabla 1). Para la mayoría de los casos clínicos, solo los valores de MIC por encima de 2 µg/mL causan dificultades para el tratamiento por lo que se consideró como punto de corte. Sin embargo, la escasa penetración de la penicilina a través de la barrera hematoencefálica hace que los aislados con una MIC superior a 0,06 µg/mL se clasifiquen como resistentes en casos de meningitis (36). Tabla 1. Puntos de corte para la determinación de resistencia a la penicilina G. Penicilina parenteral Sensibles Intermedio Resistente No meníngeas ≤2 4 ≥8 Meníngeas ≤0.06 - ≥0.12 Las concentraciones del antibiótico están dadas en µg/mL (35). En una investigación realizada en Canadá en el que se compararon las zonas de inhibición de la prueba ODD con los MICs de la penicilina encontraron que el 98% de las cepas neumocócicas con zonas de inhibición ≤ 19 mm no eran susceptibles a la penicilina (se trabajaron con 1116 cepas se aisladas de fluidos corporales normalmente estériles y del tracto respiratorio). Con base en esos resultados y otro estudios, dicha prueba se ha estado utilizando como un predictor de no susceptibilidad a penicilina. Aunque, cabe recalcar que estas investigaciones utilizaron los anteriores puntos de corte 8 que establecía; sensibles ≤0.06, intermedio 0.12 -1.0 y resistentes ≥2.0 µg/mL y no distinguía entre cepas meníngeas y no meníngeas (37). Asimismo, en un estudio en la que se aislaron cepas de S. pneumoniae a partir de niños sanos de 2 a 24 meses de edad provenientes de varios hospitales y centros de salud peruanos entre 2007 y 2009, se halló una buena correlación entre las zonas de inhibición del ODD y los puntos de corte meníngeos de la penicilina, pero una correlación débil respecto a no meníngeos. Por lo tanto, la prueba ODD parece ser una herramienta útil para predecir la resistencia a la penicilina en casos de cepas meníngeas de S. pneumoniae, particularmente en países de ingresos bajos y medianos, donde la determinación de la MIC no está disponible de manera rutinaria (38). Además, para cepas no meníngeas un MIC ≤0.06 a penicilina G puede predecir susceptibilidad a otros betalactámicos: ampicilina (oral o parenteral), amoxicilina, ceftriaxona, cefepime entre otros (35). 1.2.4 Mecanismos moleculares de resistencia a penicilina G El peptidoglicano es el principal constituyente de la pared celular de neumococo. Esta capa protege a la bacteria de la presión de turgencia y es un andamio para anclar otras moléculas de la superficie (39). Asimismo, su ensamblaje dinámico es esencial para la división celular y la determinación de la forma de la bacteria (40, 41). El peptidoglicano de neumococo está compuesto por una red multicapa de cadenas de glicano de residuos alternos de N-acetilglucosamina y acido N-acetilmurámico conectados a través de péptidos (39). Las PBPs son enzimas que catalizan los últimos pasos de la formación del peptidoglicano y están asociadas a la membrana citoplasmática. Neumococo presenta seis PBPs las cuales han sido clasificadas según la similitud de secuencia en tres clases: A, B y C. Las tres PBP clase A (PBP1a, PBP1b y PBP2a) son enzimas bifuncionales que polimerizan cadenas de glucanos (actividad glicosiltransferasa) y las unen a través de enlaces peptídicos (actividad transpeptidasa). Las dos PBP de clase B (PBP2x y PBP2b) son transpeptidasas y PBP3 es un PBP clase C con actividad carboxipeptidasa, la cual está envuelta en la maduración del peptidoglicano (42). Mientras las PBPs de 9 clase A y C no son esenciales en neumococo (43,44), ambas PBPs de clase B son necesarios: PBP2b es esencial para la elongación y PBP2x para la división (45–49). Las penicilinas forman un complejo covalente bastante estable con las PBPs vía su sitio activo serina. De esta manera, son enzimáticamente inactivas y por lo tanto se produce la lisis de neumococo (Figura 3) (20, 50,51). La resistencia en el caso de penicilina G se debe principalmente a alteraciones en los dominios transpeptidasa ubicados dentro de los genes pbp1a, pbp2b y pbp2x.Estas PBPs alteradas son menos afines a la penicilina y su función no se ve afectada (52). Estudios realizados con cepas clínicas muestran que para conferir un alto nivel de resistencia es necesario mutaciones en los genes pbp1a, pbp2b y pbp2x y para conferir resistencia intermedia solo se necesita que uno de ellos esté mutado, aunque la mutación de pbp1a se asocia a un mayor valor de MIC. Por otro lado, las dobles mutantes pbp1a /2x y pbp2x/2b presentan resistencia de menor nivel (53,54). Figura 3. Representación esquemática del mecanismo de acción de penicilina. El peptidoglicano está compuesto de cadenas de polisacáridos hechos de unidades de GlcNAc y MurNAc (mostrados en diferentes tonalidades de azul) los cuales están unidos por pequeños péptidos. La enzima transpeptidasa (PBP) (en marrón) cataliza la unión entre estos péptidos, específicamente uniendo los dos residuos de D-alanina de un péptido (círculos rojos). La penicilina imita la estructura de estos residuos e inactiva las PBPs formando una unión covalente irreversible con el aminoácido serina de la enzima (20). Las secuencias de ADN del dominio transpeptidasa en cepas de S. pneumoniae sensibles a la penicilina están bien conservadas; a diferencia de las cepas resistentes, las 10 cuales contienen bloques de secuencia de diferentes longitudes que difieren en más del 20%, denominado mutaciones en mosaico (Figura 4). Estas PBP contienen motif de aminoácidos conservados SXXK, SXN y KXG, que son responsables de la actividad transpeptidasa y mutaciones en estas regiones son las confieren resistencia. La longitud de los bloques de mosaico incluyen no solo partes del dominio transpeptidasa sino en algunos casos hasta la región de codificación de la proteína completa como resultado de transferencia de genes con otros Streptococcus comensales orales seguidos de eventos de recombinación (52,55-57). Figura 4. Mutaciones en mosaico de genes pbp2x de aislados clínicos. Los diferentes colores indican que las secuencias difieren de todos los demás en aproximadamente 20% (52). Además de las pbps, el gen murM que codifica una proteína del mismo nombre ha sido involucrado en la resistencia de neumococo a penicilina. MurM es una enzima que cataliza la transferencia de L-serina o L-alanina a la lisina de la rama peptídica del Lípido II durante la formación del peptidoglicano (58). Algunas cepas resistentes presentaban mutaciones en mosaico en el gen murM y contenían una mayor cantidad de muropéptidos en su pared en comparación con cepas sensibles, lo que indica que las 11 mutaciones incrementan la actividad de MurM (59). En la actualidad se han descrito 10 variantes con considerables polimorfismos en el gen murM en cepas resistentes a penicilina, los cuales se han denominado alelos B1 a 10 (58,60). Se ha denominado murMA al alelo murM sin mutaciones (58). Du Plessis y equipo señalan que para conferir un alto nivel de resistencia a penicilina en neumococo se requiere tanto de una remodulación extensa de las pbps y de ciertas mutaciones del gen murM, dado que se podría recuperar por completo la eficiencia en la construcción de la pared celular cuando MurM es alterada (61). La secuenciación del genoma completo (WGS por sus siglas en inglés, Whole-genome sequencing) es una herramienta eficaz para la investigación de la resistencia a los antibióticos; sin embargo, su elevado costo no permite su empleo de rutina, por lo que para este estudio se usó la técnica de PCR como una alternativa viable (62). Cabe señalar que se empleó cebadores que amplifican solo regiones no alteradas dentro de motif conservados del dominio transpeptidasa de las pbps y respecto al gen murM los cebadores también amplifican secuencias conservadas. (5, 63,64). I.3 Serotipos y resistencia antibiótica La introducción de la vacuna neumocócica 7 valente, seguido por la 10 y 13 valente dirigido contra los serotipos más frecuentes altamente virulentos y resistentes a penicilina en los programas nacionales de inmunización de muchos países, resultó en un significante decrecimiento de infecciones causadas por dichas cepas tanto en niños como en adultos. Sin embargo, se han incrementado las cepas resistentes a antibióticos que expresan serotipos no incluidos en las vacunas debido a la diseminación de genes alterados hacia nuevas clonas, como resultado de la increíble propiedad de transformación genética de neumococo (65-67). II. Justificación del estudio Las penicilinas (penicilinas G, V, clemizol y amoxicilina) son la primera opción para el tratamiento de enfermedades neumocócicas (2); sin embargo, la aparición de cepas resistentes es preocupante porque implica la necesidad de terapias de segunda línea, como cefalosporinas y macrólidos, las cuales son más costosas y con mayores efectos secundarios (2). Aunque la incursión de vacunas ha logrado disminuir este problema la 12 aparición de serotipos no vacunales resistentes requiere que se siga conociendo los mecanismos moleculares (63-65). Por estas razones, la Organización Mundial de la Salud recomienda realizar la vigilancia genómica de la resistencia antibiótica. Entre las técnicas moleculares, la reacción en cadena de la polimerasa (PCR por sus siglas en inglés, Polymerase Chain Reaction) es la que ha adquirido un mayor valor en la caracterización de los genotipos de resistencia bacterianos (68). El amplio rango de MIC observado en aislados clínicos indica claramente que no hay un solo mecanismo, como la presencia de una enzima diana especial, sino que la resistencia en S. pneumoniae es un complejo proceso multifactorial (52). El presente estudio se enfoca en determinar la presencia de genes pbps y murM alterados debido a que son los genes más frecuentemente asociados a la resistencia a penicilina en cepas clínicas. Las mutaciones en pbps2x son un requisito previo para la resistencia; además, pbp2b y pbp1a confieren un aumento adicional en el MIC sin cambios en otros genes pbps o no pbps (53) (54). Asimismo, PBP2x y PBP2b son proteínas esenciales y representan el objetivo principal de las penicilinas. Por otra parte algunas cepas resistentes presentan mutaciones en murM el cual al ser bloqueado implica la pérdida del fenotipo de resistencia (5,8). En la presente tesis se estandarizó dos sistemas de PCR múltiple para detectar la presencia de genes alterados asociados a la resistencia a penicilina. III. Pregunta de investigación ¿Los genes pbp2x, pbp2b, pbp1a y murM alterados están asociados a la resistencia a penicilina en cepas invasivas y colonizadoras de S. pneumoniae aisladas de niños de Lima? IV. Objetivos IV.1 Objetivo general Determinar los mecanismos de resistencia a penicilina en cepas de S. pneumoniae aislados de niños con enfermedad neumocócica invasiva y niños portadores sanos de Lima a través del estudio de los genes pbp2x, pbp2b, pbp1a y murM. 13 IV.2 Objetivos específicos  Estandarizar un sistema de reacción en cadena de la polimerasa convencional para detectar genes pbp2x, pbp2b, pbp1a y murM alterados.  Determinar la frecuencia genes pbp2x, pbp2b, pbp1a y murM alterados.  Comparar la presencia de genes pbp2x, pbp2b, pbp1a y murM alterados entre cepas invasivas y portadoras  Determinar la correlación entre el número de genes alterados y el MIC.  Determinar la asociación entre la presencia de los genes pbps y murM alterados y la resistencia a penicilina. V. Materiales y métodos V.1 Población y muestra Para esta tesis se utilizaron las cepas de Streptococcus pneumoniae que fueron colectadas a partir de dos estudios que se realizaron en el Laboratorio de Infectología Pediátrica de la Universidad Peruana Cayetano Heredia. El primero es “Determinación de Serotipos y Sensibilidad Antibiótica en pacientes hospitalizados por Enfermedad Neumocócica Invasiva en Lima – ENI III” (Estudio ENI-III) y el segundo es “Distribución de serotipos y sensibilidad antibiótica de neumococo en niños portadores nasofaríngeos luego de la introducción de la vacuna 13-valente en Lima, Perú” (Estudio portadores II). En ambos casos el muestreo se realizó por conveniencia. Las cepas fueron identificadas basado en la morfología de la colonia, presencia de alfa hemólisis, coloración Gram, solubilidad en bilis y sensibilidad a la optoquina. Posteriormente fueron criopreservadas en el medio STGG (skim milk, soja- triptona, glucosa y glicerol) y almacenadas a -70 °C. V.1.1 Población para el primer estudio Cepas de S. pneumoniae provenientes de pacientes con ENI (Enfermedad Neumocócica Invasiva) menores de 14 años que fueron internados en diferentes clínicas y hospitales en Lima durante el período noviembre 2016 a mayo del 2019. Se recolectaron un total de 71 cepas correspondieron a niños menores de 14 durante dicho periodo de las cuales 61 fueron no sensibles por el disco oxacilina; sin embargo, 1 cepa no amplifico lytA por lo que fue excluida obteniéndose finalmente 60 cepas para este estudio. 14 Criterio de inclusión Cepas de S. pneumoniae aislados de muestras clínicas normalmente estériles (hemocultivo, líquido cefalorraquídeo (LCR), líquido pleural, líquido peritoneal) o cultivo de biopsia de pacientes menores a 14 años con ENI, Cepas de neumococo no sensibles mediante el método de difusión en disco de oxacilina. Criterios de exclusión Cepas que no amplificaron lytA. Se utilizó el gen lytA que codifica la enzima autolisina específica para neumococo como control interno, dado que la ausencia de bandas indicaba que el gen esta mutado. De las cepas invasivas una no amplifico lytA, por lo que no fue considerada en los análisis posteriores. Cálculo de la precisión del tamaño de muestra Dado que se dispone de una muestra de 60 cepas que cumplen los criterios de inclusión se calculara la precisión del tamaño de la muestra con la siguiente formula: Dónde: n = Tamaño de la muestra Z=Parámetro estadístico que depende del nivel de confianza A=Precisión p =Probabilidad que ocurra el evento estudiado (éxito) q = Probabilidad que no ocurra el evento estudiado Basado en un estudio previo, el porcentaje de cepas invasivas resistentes es 46.2% (20). El nivel de confianza es de 95%. Reemplazando: √ 15 = 0.1260=12.60% La precisión es de 12.08%. Lo recomendable es menos de 10%. V.1.2 Población para el segundo estudio Cepas de neumococo aislados de niños sanos de 2 meses a 2 años de edad, atendidos en la consulta externa de pediatría, control del niño sano o consultorio de vacunación de los hospitales participantes en el estudio colectadas en enero del 2018 hasta julio 2019. De un total de 201 cepas que fueron aisladas durante dicho periodo 150 fueron no sensibles por el disco de oxacilina y de estas 136 amplificaron lytA. Para el presente estudio solo se incluyen cepas que amplificaron lytA. Criterio de inclusión Cepas aisladas de muestras nasofaríngeas de niños sanos de acuerdo a la definición del estudio de niños portadores sanos (quienes no padecen de ninguna enfermedad importante como neumonía probable, sepsis, bacteremia, meningitis/encefalitis) de 2 meses a 2 años de edad que acudieron a sus controles de niño sano en cinco hospitales. Cepas de neumococo no sensibles mediante el método de difusión en disco de oxacilina. Criterios de exclusión Cepas que no amplificaron lytA. De las 150 cepas que cumplían los criterios de inclusión, 14 no amplificaron dicho gen. Cálculo de la precisión del tamaño de muestra En un estudio previo se calculó que el porcentaje de cepa colonizadoras resistentes a penicilina en Lima es de 57% (32). El número de cepas disponibles es de 136. El nivel de confianza es de 95% por lo que reemplazando en la fórmula anterior se obtiene lo siguiente: √ A=0.0832= 8.19%. La precisión de la muestra es de 8.19% 16 V.2 Extracción de DNA de cepas de S. pneumoniae Las cepas criopreservadas de neumococo fueron reactivadas en agar sangre (TSA suplementado con 5 % de sangre de carnero) e incubadas durante 24 horas a 37°C en condiciones de anaerobiosis. La extracción de ADN se realizó re-suspendiendo las cepas de neumococo en una solución de 200 µl de Chelex-100® (Bio-Rad, Richmond, CA) al 5% suplementado con 2 µl proteinasa K (20 mg/ml), la cual se incubó a 56° C durante 60 minutos, se homogenizó durante 10 segundos y se incubó a 95°C por 15 minutos, se homogenizó y centrifugó a 13 000 rpm durante cinco minutos y se almacenó -20°C hasta su análisis por PCR. La cantidad y calidad del ADN extraído se evaluó en equipo Nano Drop ™ Espectrofotómetro ND-10 (Thermo Scientific). V.3 Estandarización de sistemas de PCR convencional La determinación de los genes de resistencia fue realizada mediante PCR convencional. Se estandarizó dos sistemas de PCR múltiple; en uno se amplificó los genes pbp2b, pbp1a y lytA y en otro pbp2x, lytA y murM. Se usó la cepa ATCC Streptococcus pneumoniae R6 sensible a penicilina que contiene los genes pbps, y murM no alterados como control positivo. Como control negativo se utilizó solamente el master mix. V.3.1 Elección de cebadores Los cebadores utilizados para la detección de los genes pbp2b, pbp2x, pbp1a, murM y lytA fueron descritos previamente en diferentes estudios (5, 62,63) (Tabla 2). Tabla 2. Cebadores usados para la amplificación de los genes de resistencia y lytA Gen Secuencia 5´- 3´ Amplicon Referencia pbp2b F CCTATATGGTCCAAACAGCCT 147pb (63) R GGTCAATTC CTGTCGCAGTA pbp2x F CCAGGTTCCACTATGAAAGTG 197 pb R ATCCCAACGTTACTTGAGTGT pbp1a F AAACCGCGACTGGGGATCAAC 239 pb (64) R GGTTGAGTCCGACCTTGTTT murM F GCTGGATCCCATGAGAAGTTTGGTGTTTA 423 pb (5) R GCTGAATTCCTGTTCGAATAGCCTGTT lytA F CAACCGTACAGAATGAAGCGG 297 pb (63) R TTATTCGTGCAATACTCGTGCG 17 Los cebadores elegidos para este estudio amplifican secuencias conservadas que están cerca del motif de aminoácidos del dominio transpeptidasa de los genes pbp1a, pbp2x, pbp2b que son altamente divergentes en cepas resistentes (62,63) Los cebadores respecto a MurM también amplifican regiones conservadas que presentan mutaciones en mosaico en cepas resistentes (5). Mediante el programa bioinformático BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) se pudo identificar la ubicación de los primers analizados en la secuencia de los genes pbps y murM de la cepa de referencia de Streptococcus pneumoniae R6. Cabe recalcar que estos cebadores no se unen a regiones reguladoras o regiones repetitivas en los cuatro genes (Anexo 1). Asimismo, para verificar que la ausencia de bandas se deba a la presencia de mutaciones y que no haya inhibidores dado que no se purifico el material genético obtenido se amplificó simultáneamente el gen lytA, que codifica la enzima autolisina, junto con los otros genes. V.3.2 Preparación del master mix para la prueba de PCR El PCR se realizó en 20 µl de master mix que contenía 2mM de MgCl, 0.4 mM de dNTPs, 32.5mU/ul polimerasa termoestable (GoTaq® G2 Flexi suplementada con buffer verde Green, marca Promega) y 0.5mM de cada primer en el caso del primer sistema de PCR trioplex 1(Anexo2) y en el caso del segundo sistema de PCR trioplex 2 se utilizó diferentes concentraciones (Anexo 3) y 2 μL de la muestra de ADN. Se procedió a su homogenización utilizando un vortex para asegurar la mezcla de los reactivos. V.3.3 Amplificación del ADN El PCR para la amplificación de ambos sistemas (trioplex 1 y 2) se realizó según las siguientes condiciones de termociclado, desnaturación inicial a 95 ℃ durante 2min, desnaturación a 95 ℃ por 15s, hibridación a 60 ℃ por 20s, extensión a 72℃ por 30s y la extensión final por 72℃ a 7 min (Anexo 4). V.3.4 Electroforesis en gel de agarosa Los fragmentos de ADN amplificados fueron analizados en un gel de agarosa al 2.5%. Esta concentración de agarosa demostró ser la adecuada para una buena resolución de los productos de amplificación de los genes dado que tamaño de los amplicones eran 18 muy cercanas entre sí. Se utilizó bromuro de etidio para la tinción del gel y la imagen se visualizó en un fotodocumentador (BioRad). Se empleó el marcador de 100 pb para estimar los productos de amplificación. La presencia de productos de amplificación (bandas) en el gel de agarosa se observaran en las cepas que no presentaban los genes pbps 2x, 2b, 1a y murM alterados. Todas las cepas que presentan la banda de lyt A representan a cepas de neumococo. V.4 Análisis estadístico Se usó el test de Fisher para establecer asociación entre el número de genes alterados y la resistencia (no sensibles). También se empleó la prueba de Spearman para establecer correlación entre el número de genes alterados y el MIC y para comparar entro los grupos se utilizó a la prueba de Kruskal-Wallis. Se emplearon dichas pruebas no paramétricas porque los valores de MIC no presentaban una distribución normal. Las diferencias fueron consideradas significativamente cuando el valor de p fue menos que 0.05. Todos análisis fueron realizados usando el Programa Stata/SE versión 17.0 (StataCorp LP, College Station, TX, USA). VI. Resultados VI. 1 Estandarización de PCR multiplex Se estandarizó dos sistemas de PCR trioplex; en uno se amplificó los genes murM, lytA, pbp2x (trioplex 1) y en otro pbp1a, pbp2b y lytA (trioplex 2 (Figura 5). La interpretación de los resultados de PCR fue la siguiente, si las bandas eran visibles, representaba que no tenían los genes alterados. Cabe recalcar que las bandas se lograron observar con nitidez y no hubo bandas inespecíficas. Con el fin de conseguir el mejor sistema de PCR, en primer lugar, se realizó PCR simplex a los genes pbps, murM y lytA con diferentes temperaturas de hibridación obteniéndose una buena amplificación en todos los casos a 60ºC (Anexo 5). Después se evaluaron 3 sistemas dúplex pbp1a-pbp2x, pbp2x-pbp2b, pbp1a-pbp2b se realizó esta combinación de genes debido a que el tamaño de sus secuencias eran parecidas. También se realizó el triplex pbp1a–pbp2b-pbp2x observándose una correcta distancia entre las bandas (Anexo 6), pero cuando se amplificaron junto a lytA y murM no hubo presencia de todas las bandas. Dado que se observó una mayor separación entre pbp1a- 19 pbp2b se consideró que se amplificaran juntos optándose finalmente por la siguiente combinación de genes lytA- pbp1a-pbp2b, murM-lytA-pbp2x. Figura Figura 5. Amplificación de genes tipo salvaje mediante electroforesis en gel de agarosa. Trioplex 1: murM, lytA, pbp2x, trioplex: 2 lytA, pbp1a y pbp2b, M: marcador de peso molecular, C-: control negativo (master mix). Concentración de agarosa al 2.5%, voltaje: 80 v, tiempo: 50 min. VI.2 Genes pbps y murM alterados en cepas invasivas y colonizadoras Se analizó la presencia de genes pbp1a, pbp2x, pbp2b y murM alterados en 60 y 136 aislados de S. pneumoniae obtenidos de muestras de diversos sitios estériles y de hisopado nasofaríngeo respectivamente. El 96.7% (58/60) de cepas invasivas y el 93.4% (127/136) de colonizadoras presentaron el gen pbp2x alterado. Las cepas con murM alterado fueron menos frecuentes en ambos grupos, 5.0% (3/60) y 13.2%(18/136) en cepas invasivas y portadoras respectivamente. La alteración en pbp2b resultó ser más prevalente en cepas colonizadoras que invasivas; caso contrario, se observó respecto a pbp1a alterado (Tabla 3). Asimismo, la mayor proporción de cepas invasivas y colonizadoras presentaron tres genes pbps alterados, pocas cepas presentaron los cuatro genes alterados. Un bajo porcentaje de cepas no presentaron alteraciones (Tabla 4). M TRIOPLEX 1 C- TRIOPLEX 2 C- pb 1500 900 500 400 300 200 100 lytA murM pbp2x pbp1a pbp2b lytA 20 Tabla 3. Frecuencia de genes pbp2x, pbp2b, pbp1a y murM alterados Gen Cepas invasivas N=60 n (%) Cepas colonizadoras N=136 n (%) pbp2x 58 (96.7%) 127(93.4%) pbp2b 42(70.0%) 120(88.2%)* pbp1a 51(85.0%) 81 (59.6%)* murM 3(5.0%) 18(13.2%) *p<0.05 según test de proporciones. Tabla 4. Número de genes pbp2x, pbp2b, pbp1a y murM alterados Número de genes alterados Cepas invasivas N=60 n (%) Cepas colonizadoras N=136 n (%) No alterado 2 (3.3%) 7(5.1%) 1 gen alterado 2(3.3%) 5(3.7%) 2 genes alterados 19(31.7%) 39(28.7%) 3 genes alterados 34(56.7%) 77(56.6%) 4 genes alterados 3(5.0%) 8(5.9%) Basados en los resultados de PCR, las cepas invasivas fueron clasificadas en seis grupos de acuerdo a los siguientes genotipos: No alterados, pbp2x alterado y las otras combinaciones de genes anormales pbp1a/pbp2x, pbp2x/pbp2b, pbp1a/pbp2b/pbp2x y los cuatro genes alterados. Por otra parte, respecto a las cepas colonizadoras se identificó nueve grupos: No alterados, cepas con pbp2x alterado, una cepa con pbp2b alterado y cepas con diversas combinaciones de genes alterados pbp1a/pbp2x, pbp2x/pbp2b, pbp2x/pbp2b/murM, pbp1a/pbp2b/murM, pbp1a/pbp2b /pbp2x y todos los genes alterados (Tabla 5). Tres genotipos pbp2b, pbp1a/pbp2b y pbp2b/murM/pbp2x alterados fueron identificados solamente en las cepas colonizadoras. En ambos grupos, la presencia de los tres genes pbps alterados fue el genotipo más frecuente (Tabla 5). 21 Tabla 5. Genotipos alterados en cepas invasivas y colonizadoras. Genotipo Cepas invasivas N=60 n (%) Cepas colonizadoras N=136 n (%) No alterado 2 (3.3%) 7(5.1%) pbp2x 2 (3.3%) 4(2.9%) pbp2b - 1(0.7%) pbp1a/pbp2x 14 (23.3%) 5(3.7%) pbp2x/pbp2b 5 (8.3%) 33(24.3%) pbp1a/pbp2b - 1 (0.7%) pbp2b/murM/pbp2x - 10(7.4%) pbp1a/pbp2b/pbp2x 34(56.7%) 67(49.3) pbp1a/pbp2b/pbp2x/murM 3(5.0%) 8(5.9%) Asimismo, se evaluó si hay diferencias en el valor de MIC de acuerdo a si esta mutado o no (Tabla 6). Tanto en cepas colonizadoras como invasivas se encontró diferencias significativas (p<0.05) en el MIC entre tener mutado o no los genes pbp1a, pbp2b y pbp2x pero no en respecto a murM. Tabla 6. Mediana de MIC de penicilina según presencia de genes alterados o no. Cepas colonizadoras N=136 Cepas invasivas N=60 Gen MIC* p MIC p pbp1a no alterado 0.38 (0.25-0.75) 0.0001 0.08 (0.02-0.19) 0.0001 alterado 0.50 (0.38- 2.00) 1.00 (0.38- 2.00) pbp2b no alterado 0.22 (0.06-0.63) 0.0006 0.25 (0.19-0.50) 0.0001 alterado 0.50 (0.38-1.50) 1.50 (0.75-3.00) murM no alterado 0.50 (0.25-1.00) 0.9379 1.50 (0.50-3.00) 0.2909 alterado 0.50 (0.38-0.75) 1.00 (1.00-3.00) pbp2x no alterado 0.06 (0.05-0.09) 0.0001 0.02(0.02-0.02) 0.0184 alterado 0.50 (0.38-1.00) 1.00 (0.25-2.00) * Mediana (p25-p75). Los valores de MIC están en µg/mL. 22 VI.3 Correlación de la susceptibilidad antimicrobial y resultado de PCR. Las cepas invasivas sin ningún gen alterado presentaron una MIC menor a 0.016 µg/ml, por otro lado, las cepas colonizadoras sin genes alterados presentaron un rango de MIC más amplio que va desde 0.016 hasta 0.094 µg/ml; como se puede observar en las Figuras 6 y 7 que muestran la distribución de MIC acorde a los genotipos identificados en cepas invasivas y colonizadoras respectivamente. Asimismo se puede observar que en ambos grupos la mayor proporción de cepas con MIC alto presentaron los 3 pbps alterados; en el caso del primer grupo va en rango de 0.023-8 - µg/ml y en el segundo de 0.19-4 -4 µg/ml. Figura 6. MIC de penicilina G según los genotipos identificados por PCR convencional en cepas invasivas de S. pneumoniae (N=60). Las flechas negras indican los puntos de corte para cepas no meníngeas: sensibles ≤2, intermedio 4 y resistentes ≥8 .Las flechas azules indican los puntos de corte para cepas meníngeas sensibles ≤0.06 y resistentes ≥0.12. 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 N ú m er o d e ce p a s MIC ( µg/ml) No mutados pbp2x pbp2x/pbp2b pbp2x/pbp1a pbp2x/pbp1a/pbp2b/ pbp2x/pbp1a/pbp2b/murM 23 0 5 10 15 20 25 30 N ú m er o d e ce p a s MIC ( µg/ml) No mutados pbp2x pbp2x/pbp2b pbp2x/pbp1a pbp2x/pbp2b/murM pbp2x/pbp1a/pbp2b pbp2x/pbp1a/pbp2b/murM Las cepas colonizadoras con mutación solo en pbp2x presentaron un mayor MIC a diferencia de las cepas invasivas, similar resultado se observó con el genotipo pbp2x/pbp2b mutado. El genotipo pbp1a/pbp2x presento un amplio rango de valores desde 0,125-2 µg/ml en cepas invasivas. Asimismo, se realizó la prueba de Spearman con el fin de evaluar la correlación entre el número de genes y los valores de MIC a penicilina. Tanto cepas invasivas (rs= 0.7108, p=0.0001) como colonizadoras (rs=0.3430, p=0.0001), presentaron una correlación positiva significativa. Figura 7. MIC de penicilina G según los genotipos identificados por PCR convencional en cepas colonizadoras de S. pneumoniae (N=136). Las flechas negras indican los puntos de corte para cepas no meníngeas: sensibles ≤2, intermedio 4 y resistentes ≥8. Las flechas azules indican los puntos de corte para cepas meníngeas sensibles ≤0.06 y resistentes ≥0.12. 24 VI.4 Asociación entre la presencia de genes alterados y la resistencia a penicilina G Para determinar la asociación entre el número de genes alterados y la resistencia se agruparon las 60 cepas invasivas y las 136 cepas colonizadoras resultando un total de 196 las cuales fueron clasificadas en sensible y no sensibles según los puntos de corte de MIC para cepas meníngeas y no meníngeas. De acuerdo a los puntos de corte no meníngeos la mayoría de cepas 85.7% (168/196) fueron sensibles a penicilina, de las cuales 5.4% (9/168) de cepas no presentaron ningún gen alterado y 86.3% (145/168) tuvieron 2 o 3 genes alterados; respecto a las cepas resistentes la mayor proporción, 24 (12%) presentaron 3 genes alterados. Cuando se utilizó los puntos de corte meníngeos, se observó que 94.9% (186/196) (94.9%) de cepas fueron resistentes de las cuales solo dos presentaron amplificación en todos los genes y la mayor proporción de estas tuvieron tres genes alterados, 59.1 % (110/186) (Tabla 7). Tabla 7. Asociación entre el número de genes alterados y la resistencia según los puntos de corte para cepas meníngeas y no meníngeas. Número de genes alterados Punto de corte meníngeo* Punto de corte no meníngeo Sensible n (%) 10 (5.1) Resistente n (%) 186 (94.9) Sensible n (%) 168 (85.7) Resistente n (%) 28(14.3) Ningún gen alterado 7(70.0) 2 (1.1) 9(5.4) 0 1 gen alterado 1(10.0) 6(3.2) 7(4.2) 0 2 genes alterados 1(10.0) 57(30.6) 58(35.2) 1(3.6) 3 genes alterados 1(10.0) 110(59.1) 87(51.7) 24(85.7) 4 genes alterados 0 11(5.9) 8(4.8) 3(10.7) Los puntos de corte de MIC según el CLSI son las siguientes; cepas no meníngeas: sensibles ≤2, intermedio 4 y resistentes ≥8. Cepas meníngeas: sensibles ≤0.06, resistentes ≥0.12. Valor de p <0.05 según test de Fisher.* Asimismo, al comparar el efecto del número de genes alterados en el valor del MIC se encontró que las cepas que no presentan genes alterados tienen uno o dos presentan 25 valores de MIC menores comparados a los que tienen 3 o 4 (Figura 8). Mediante la prueba de Kruskal-Wallis se encontraron diferencias significativas entre el número de genes alterados respecto al MIC con un valor de p=0.0001. Figura 8. Valores de MIC (µg/ml) según el número de alterados (N=196). VII. Discusión Cuando se introdujo la penicilina en 1942, el neumococo era sensible a este antibiótico con un MIC de alrededor de 0.01 mg/ml. Las cepas de Streptococcus pneumoniae no sensibles a la penicilina se detectaron por primera vez en la década de 1960 (68) y ahora son comunes en todo el mundo, debido principalmente a la propagación de los serotipos 14, 23F, 19F, 19A, 9V y 6B que son altamente virulentos y a su vez resistentes a penicilina (67). En la presente tesis se logró estandarizar dos PCR multiplex para la detección de los principales genes asociados a la resistencia a penicilina; en uno de ellos se amplificaron los genes murM, lytA, pbp2x (trioplex 1) y en otro lyt, pbp1a y pbp2b (trioplex 2). Se utilizó el gen lytA como control interno, dado que la ausencia de bandas indicaba que el gen esta mutado. Dichos sistemas de PCR son una contribución importante para la investigación de mecanismos de resistencia en neumococo dado que a diferencia de otros estudios este incluye la detección de alteraciones en el gen murM (5,63-64). Número de genes alterados M IC ( µ g /m l) 26 Todas las cepas de este estudio eran no sensibles a penicilina según el disco de oxacilina; es decir, se seleccionaron aislados con zonas de inhibición ≤ 19 mm, debido a que dichas zonas se relacionan generalmente a resistencia, aunque también a susceptibilidad cuando se realiza posteriormente la determinación del MIC. Sin embargo, el porcentaje de resistencia antibiótica según el MIC fue baja cuando las cepas de este estudio fueron clasificadas según los puntos de corte para cepas no meníngeas. Lo cual indica que hay una sobreestimación de la resistencia según el método del disco de oxacilina, observándose lo contario cuando se aplica los puntos de corte meníngeos. Este resultado coincide con la investigación realizada por Horna et al. (2016), en la que se halló una buena correlación entre las zonas de inhibición del ODD y los puntos de corte meníngeos de la penicilina, pero una correlación débil respecto a no meníngeos (38). La mayoría de cepas tanto invasivas como colonizadoras presentaron el gen pbp2x alterado siendo los porcentajes 96.9% y 93.3% respectivamente. Se ha propuesto que las cepas que presentan susceptibilidad a la penicilina y zonas de inhibición de ODD reducidas tienen alteraciones en la proteína PBP2X. Estas alteraciones solo causarían un ligero efecto en el MIC de penicilina, que se esperaría que permaneciera por debajo de los puntos de corte, pero podría producir un efecto visible en los resultados de oxacilina; este mecanismo se describió en un estudio realizado por Dowson et al. en 1994 (70). Asimismo, estos resultados coinciden con un estudio realizado con cepas aisladas principalmente de esputo tanto de niños como adultos en Japón, cabe señalar que en esta investigación se utilizaron los mismos cebadores que en esta tesis; en el cual el 79.8% de cepas de un total de 328 presentaron el gen pbp2x mutado (64).También coinciden con dos estudios realizados en Japon en el 2006 y 2012 (71,72). El uso intensivo de la terapia con penicilinas como amoxicilina y cefalosporinas de tercera generación en los últimos años podrían haber jugado un papel en la creación de una presión de selección que permitió el desarrollo de neumococos con susceptibilidad reducida a la penicilina debido a que dichos antibióticos son altamente efectivos inhibiendo pbp2x (73,74). Todos los genotipos alterados que se identificaron en ambos grupos incluyen pbp2x, lo cual coincide con el resultado de varios estudios en que se observaron que estas mutaciones son el primer paso hacia altos niveles de resistencia a los antimicrobianos sin cambios en otros genes pbps o no-pbps (52). Asimismo, la alteración en pbp2b 27 resultó ser más prevalente en cepas colonizadoras que invasivas; caso contrario, se observó respecto a la alteración de pbp1a, lo cual coincide con los estudios realizados en aislados de cepas de la zona nasofaríngeas y de pacientes con IPD en niños de Japón (71,72). Alteraciones tanto en pbp2x y pbp2b son requeridos para elevar el MICs a todas las penicilinas. También se ha observado que cambios adicionales a pbp1a son necesarios para conferir alto nivel de resistencia tanto a penicilinas y cefalosporinas (75, 76). Por otro parte, la presencia de murM alterado fue menos frecuentes en ambos grupos. Respecto a nuestra investigación; aunque en el caso de las cepas invasivas se obtuvo valores altos de MIC de 8 y 4 mg/ml estas no presentaron el gen murM alterado, pero si hubo cepas que presentaron los cuatro genes alterados con MIC de 1 y 3 mg/ml. Asimismo, las cepas colonizadoras presentaron un MIC promedio 0.925, si bien algunas presentaron un MIC de hasta 4 mg/ml no tuvieron a murM mutado. Por lo tanto la presencia de dicho gen alterado no incrementa el valor de MIC. En el año 2001 se reportó por primera vez a las mutaciones en murM como un factor clave en la alta resistencia de la cepa húngara 3191 que presentaba un MIC de 16 y 4 mg/ml para penicilina y cefotaxime respectivamente (58). Un estudio revelo que la cepa de S. pneumoniae Serotipo 19A aislado en Hungría altamente resistente a penicilina presentaba también murM mutado así como de pbp2x, pbp1a (77). Por estas investigaciones se esperaba que las cepas con mayor valor de MIC tengan murM alterado lo cual no coincidió con los resultados hallados en el presente estudio. Todas las cepas de este estudio eran no sensibles a penicilina según el disco de oxacilina; es decir, se seleccionaron aislados con zonas de inhibición ≤ 19 mm, debido a que dichas zonas se relacionan generalmente a resistencia, aunque también a susceptibilidad cuando se realiza posteriormente la determinación del MIC. Sin embargo, el porcentaje de resistencia antibiótica según el MIC fue baja cuando las cepas de este estudio fueron clasificadas según los puntos de corte para cepas no meníngeas. Lo cual indica que hay una sobreestimación de la resistencia según el método del disco de oxacilina, observándose lo contario cuando se aplica los puntos de corte meníngeos. Este resultado coincide con la investigación realizada por Horna et al. (2016), en la que se halló una buena correlación entre las zonas de inhibición del ODD y los puntos de 28 corte meníngeos de la penicilina, pero una correlación débil respecto a no meníngeos (38). La mayoría de cepas tanto invasivas como colonizadoras presentaron el gen pbp2x alterado siendo los porcentajes 96.9% y 93.3% respectivamente. Se ha propuesto que las cepas que presentan susceptibilidad a la penicilina y zonas de inhibición de ODD reducidas tienen alteraciones en la proteína PBP2X. Estas alteraciones solo causarían un ligero efecto en el MIC de penicilina, que se esperaría que permaneciera por debajo de los puntos de corte, pero podría producir un efecto visible en los resultados de oxacilina; este mecanismo se describió en un estudio realizado por Dowson et al. en 1994 (70). Asimismo, estos resultados coinciden con un estudio realizado con cepas aisladas principalmente de esputo tanto de niños como adultos en Japón, cabe señalar que en esta investigación se utilizaron los mismos cebadores que en esta tesis; en el cual el 79.8% de cepas de un total de 328 presentaron el gen pbp2x mutado (64).También coinciden con dos estudios realizados en Japon en el 2006 y 2012 (71,72). El uso intensivo de la terapia con penicilinas como amoxicilina y cefalosporinas de tercera generación en los últimos años podrían haber jugado un papel en la creación de una presión de selección que permitió el desarrollo de neumococos con susceptibilidad reducida a la penicilina debido a que dichos antibióticos son altamente efectivos inhibiendo pbp2x (73,74). Todos los genotipos alterados que se identificaron en ambos grupos incluyen pbp2x, lo cual coincide con el resultado de varios estudios en que se observaron que estas mutaciones son el primer paso hacia altos niveles de resistencia a los antimicrobianos sin cambios en otros genes pbps o no-pbps (52). Asimismo, la alteración en pbp2b resultó ser más prevalente en cepas colonizadoras que invasivas; caso contrario, se observó respecto a la alteración de pbp1a, lo cual coincide con los estudios realizados en aislados de cepas de la zona nasofaríngeas y de pacientes con IPD en niños de Japón (71,72). Alteraciones tanto en pbp2x y pbp2b son requeridos para elevar el MICs a todas las penicilinas. También se ha observado que cambios adicionales a pbp1a son necesarios para conferir alto nivel de resistencia tanto a penicilinas y cefalosporinas (75, 76). Por otro parte, la presencia de murM alterado fue menos frecuentes en ambos grupos. Respecto a nuestra investigación; aunque en el caso de las cepas invasivas se obtuvo 29 valores altos de MIC de 8 y 4 mg/ml estas no presentaron el gen murM alterado, pero si hubo cepas que presentaron los cuatro genes alterados con MIC de 1 y 3 mg/ml. Asimismo, las cepas colonizadoras presentaron un MIC promedio 0.925, si bien algunas presentaron un MIC de hasta 4 mg/ml no tuvieron a murM mutado. Por lo tanto la presencia de dicho gen alterado no incrementa el valor de MIC. En el año 2001 se reportó por primera vez a las mutaciones en murM como un factor clave en la alta resistencia de la cepa húngara 3191 que presentaba un MIC de 16 y 4 mg/ml para penicilina y cefotaxime respectivamente (58). Un estudio revelo que la cepa de S. pneumoniae Serotipo 19A aislado en Hungría altamente resistente a penicilina presentaba también murM mutado así como de pbp2x, pbp1a (77). Por estas investigaciones se esperaba que las cepas con mayor valor de MIC tengan murM alterado lo cual no coincidió con los resultados hallados en el presente estudio. Hubo asociación entre el número de genes alterados y la resistencia solo cuando se emplearon puntos de corte meníngeos. De acuerdo a este punto, de las 186 cepas resistentes, solo 2 no presentaron los genes alterados y 110 tuvieron 3 genes alterados. Este resultado coincide con lo hallado en dos estudios. En uno se trabajó con 148 cepas de neumococo de varios países mayormente de EEUU, donde se identificó que de las 47 cepas resistentes, 41 (87.2%) tuvieron las 3 pbps alteradas, 6 (12.8%) tuvieron alterado pbp1a y pbp2x. 38(86.4%) de las 44 cepas susceptibles a penicilinas tuvieron pbps no alterados, mientras solo 6 aislados (13.6%) tuvieron 1 o dos alteraciones. Cabe recalcar que esta investigación se usó los siguientes puntos de corte que desde el 2008 ya no se aplican que definían sensibles, intermedio y resistente como ≤0.06, 0.12-1 y ≥2 mg/L respectivamente (63). Asimismo, según otro estudio en el que se detectaron pbps alterados en 101 cepas invasivas aisladas de niños menores de 16 años hospitalizados en Lima entre 2006 y 2008; las cepas meníngeas consideradas resistentes presentaban alteraciones mientras que las susceptibles aún conservaban sus pbps sin modificación 20/21 (95%), en cuanto a las cepas no meníngeas más de la mitad de susceptibles tenían al menos un gen pbp alterado 34/57 (60%), de los cuales la mayoría de los aislamientos tenían los tres genes pbps alterados (78). Las figuras 7 y 8 muestran la distribución de MIC acorde a los resultados de PCR con el fin de comparar la influencia de cada alteración. Las cepas invasivas sin ningún gen alterado presentaron una MIC menor a 0.016 µg/ml, por otro lado, las cepas 30 colonizadoras sin alteraciones presentaron un rango más amplio que va desde 0.016 hasta 0.094 µg/ml. Asimismo, se observó una buena correlación positiva entre los valores de MIC y el número de genes pbp alterados. Estos resultados concuerdan con el estudio realizado con cepas peruanas antes mencionado en la cual la mayoría de las cepas 42/48 (88%) con valores de MIC de penicilina en el rango bajo (0,003-0,064 ug / mL) no tenían ningún gen pbp alterado; mientras que la mayoría de las cepas 39/45 (87%) con valores de MIC de penicilina en el rango alto (0,5-32 ug / mL) tenían los tres genes pbps alterados (78). La correlación observada en esta tesis también coincide con los estudios realizados en Japón (63,64). La extensa variación de niveles de susceptibilidad a penicilina que se observa en el presente estudio evidencia la compleja genética de resistencia de S. pneumoniae descrita ya en otras publicaciones, en la cuales indican que el desarrollo de resistencia puede ser influenciado por mutaciones en otros genes pbps y no pbps. De hecho, proteínas PBP1b y PBP2a de baja afinidad a penicilina han sido reportadas previamente. Estudios señalan que cepas altamente resistentes tenían alteradas hasta cinco de las seis proteínas neumocócicas que se unen a la penicilina (52). El alto número de cepas con pbps alterados en cepas invasivas y colonizadoras se puede deber al intercambio de material de genético entre neumococo con otras especies y a mutaciones compensatorias. La colonización de la nasofaringe es un paso importante para el desarrollo de resistencia antimicrobiana debido a que proporciona el ambiente para la interacción entre neumococo y otros estreptocócicos comensales como Streptococcus oralis y Streptococcus mitis. Aunque estas especies no son naturalmente resistentes al parecer las alteraciones que confieren la no sensibilidad a la penicilina han surgido como una variación neutral, o surgieron bajo presión de selección, en estas especies donantes antes de ser importadas a S. pneumoniae a través de la transformación. S. mitis es un donante neumocócico más frecuente de fragmentos de pbps y una fuente de mayor diversidad de nucleótidos en comparación con S. oralis. Los neumococos que adquirieron fragmentos de pbps presentaron un valor de MIC más alto para la penicilina en comparación con los neumococos sin fragmentos adquiridos. Además, se ha observado que neumococo puede desarrollar mutaciones compensatorias que permiten que las proteínas PBPs mantengan su papel fisiológico en el metabolismo de la pared celular, al tiempo que tienen una menor afinidad por la penicilina (79-80). 31 Asimismo, son limitaciones del estudio el no haber incluido también cepas sensibles por el disco de oxacilina, de esta manera tener un visión más amplia sobre el efecto de los genes estudiados. Además, solo se analizaron los genes pbps más frecuentes asociados a la resistencia. VIII. Conclusiones  Se estandarizó dos sistemas trioplex de reacción en cadena de la polimerasa convencional que permitieron amplificar genes no alterados de cepas invasivas y colonizadoras.  El 96.7% (58/60) invasivas así como el 93.4% (127/136) colonizadoras presentaron el gen pbp2x alterado. Por otra parte, las cepas con murM alterado fueron menos frecuentes en ambos grupos 5.0% (3/60) en cepas invasivas y 13.2%(18/136) en cepas de portadores.  La alteración en pbp2b resultó ser significativamente más prevalente en cepas colonizadoras que invasivas; caso contrario, se observó respecto a pbp1a  La presencia de un mayor número de genes alterados incrementa el valor del MIC tanto en cepas invasivas como en colonizadoras.  La presencia de genes pbps alterados afectan la resistencia, los cuales se evidencian únicamente cuando se consideran puntos de corte meníngeos en cepas no-sensibles a penicilina según el disco de oxacilina. IX. Recomendaciones Con el fin de ampliar el conocimiento de los mecanismos de resistencia a penicilina sería recomendable emplear tecnologías como secuenciación del genoma completo que nos brindarían más información sobre los genes evaluados en este estudio y permitirían a su vez identificar otros genes asociados a las resistencia (82). X. Referencias bibliográficas 1. Wahl B, O'Brien KL, Greenbaum A, et al. Burden of Streptococcus pneumoniae and Haemophilus influenzae type b disease in children in the era of conjugate vaccines: 32 global, regional, and national estimates for 2000-15. Lancet Glob Health. 2018; 6(7):e744-e757. 2. Bush LM. Pneumococcal Infections [Internet]. MSD Manual Consumer Version. [Citado el 16 de abril de 2022]. Disponible en: https://www.msdmanuals.com/home/infections/bacterial-infections-gram-positive- bacteria/pneumococcal-infections 3. McGee L, McDougal L, Zhou J, et al. 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Mol Microbiol. 1991;5:1993–2002. doi: 10.1111/j.1365- 2958.1991.tb00821.x. 80. Dowson CG, Coffey TJ, Kell C, Whiley RA. Evolution of penicillin resistance in Streptococcus pneumoniae; the role of Streptococcus mitis in the formation of a low affinity PBP2B in S. pneumoniae. Mol Microbiol. 1993; 9:635–643. XI. Anexos Anexo 1: Ubicación de los primers en la secuencia de los genes pbps y murM de la cepa Streptococcus pneumoniae R6. Gen Primer Ubicación en cepa Streptococcus pneumoniae R6 pbp2b F: CCTATATGGTCCAAACAGCCT R: GGTCAATTCCTGTCGCAGTA pbp2x F:CCAGGTTCCACTATGAAAGTG R:ATCCCAACGTTACTTGAGTGT Gen Primer Ubicación en cepa Streptococcus pneumoniae R6 pbp1a F:AAACCGCGACTGGGGATCAAC R:GGTTGAGTCCGACCTTGTTT murM F:GCTGGATCCCATGAGAAGTTTGGTGTTTA R:GCTGAATTCCTGTTCGAATAGCCTGTT Anexo 2. Master mix para la amplificación de genes murM, lytA, pbp2x (trioplex 1). Reactivo Conc. Inicial Conc. Final Vol. 1 RX (µl) Agua 7.2 Buffer 5X 1X 4 MgCl 25mM 2mM 1.6 dNTP 10mM 0.4mM 0.5 lytA F-R 10mM 0.2mM 0.3 pbp2x F-R 10mM 0.5mM 1 MurM F-R 10mM 0.4mM 1 enzima 5 U/ µL 32.5mU/ µL 0.13 ADN 2 Total vol. 17.03 Anexo 3. Master mix para la amplificación de genes pbp1a, pbp2b y lytA (trioplex 2) Componente Conc. Inicial Conc. Final Vol1 RX (µl) agua PCR 5.8 buffer 5X 1X 4 MgCl 25mM 2Mm 1.6 dNTPs 10mM 0.4Mm 0.5 lytA F-R 10mM 0.5Mm 1 pbp2b F-R 10mM 0.5Mm 1 pbp1a F-R 10mM 0.5Mm 1 enzima 5 U/ul 32.5mU/Ul 0.13 ADN 2 Total vol. 17.03 Anexo 4. Ciclos de amplificación utilizados en el proceso de estandarización Etapa Temperatura Tiempo Desnaturación inicial 95 ℃ 2min Desnaturación 95 ℃ 15s Hibridación 50, 52.5, 55, 57.5, 60 y 62.5℃ 20s Extensión 72℃ 30s Extensión final 72℃ 7 min Anexo 5. Evaluación de sistemas de PCR convencional. Temperatura de alineamiento, Cº Curva de temperatura de PCR. Todas las reacciones fueron evaluadas en una sola corrida. La temperatura de alineamiento de 60 °C es la que proporciona la más alta especificidad y mejor visibilidad de bandas. Electroforesis en gel de agarosa al 1.5% con TBE al 0.5X con 10uL de master mix. La corrida fue a 90 voltios por 50 min. lytA pbp2x pbp2b M 49.5 53 56.5 60 63.5 67 murM pbp1a 1500 500 400 300 200 100 pb 1000 500 400 300 200 100 1000 500 400 300 200 100 1500 400 300 200 100 1000 400 300 200 100 Anexo 6. Sistemas dúplex y triplex de los genes pbps. Electroforesis en gel de agarosa al 1.5% con TBE al 0.5X. La corrida fue a 90 voltios por 50 min. Se corrió a 10uL de master mix. M: marcado de peso molecular, carriles 3,6,9,12: Controles negativos. No hubo amplificación en carril 10.