EVALUACIÓN INMUNOLÓGICA in vitro E in vivo DE LA GLICOPROTEÍNA J DEL VIRUS DE LARINGOTRAQUEITIS INFECCIOSA AVIAR EXPRESADA EN LA ENVOLTURA VIRAL DE BACULOVIRUS TESIS PARA OPTAR EL GRADO DE MAESTRO EN BIOQUÍMICA Y BIOLOGÍA MOLECULAR SANDRA STEFFANY MORALES RUIZ LIMA – PERÚ 2018 Asesor Interno: Mirko Zimic Peralta PhD. Asesor Externo: Manolo Clemente Fernández Díaz M.V. MSc. Agradecimientos Al Programa Nacional de Innovación para la Competitividad y Productividad (InnóvatePerú) del Ministerio de la Producción por financiar el presente trabajo de investigación. A Manolo Fernández Díaz M.V. MSc. por su asesoramiento y permitir mi participación en este trabajo de investigación mediante el desarrollo de la presente tesis. A Mirko Zimic Peralta PhD. por sus sugerencias y asesoramiento a lo largo de la presente tesis A la empresa Farmacológicos Veterinarios S.A.C. por el financiamiento brindado para realizar mis estudios de maestría. Al Laboratorio de Biología Molecular y Genómica, Farmacológicos Veterinarios S.A.C. por facilitarme el uso de sus instalaciones para la realización de la presente tesis. De manera especial a MSc. Jorge Bendezú por su paciencia y compañía a lo largo de este reto. A mi familia por su apoyo incondicional y a mis queridos sobrinos Fabrizzio y Joaquin por alegrar mis días con sus ocurrencias y sus risas. Fuentes de Financiamiento La presente tesis fue financiada por el Programa Nacional de Innovación para la Competitividad y Productividad (InnóvatePerú) del Ministerio de la Producción del Perú a través del trabajo de investigación con Convenio 007-FINCyT-FIDECOM- PIPEI-2014. Los estudios de maestría fueron financiados por la empresa Farmacológicos Veterinarios S.A.C. CONTENIDO Lista de Tablas ............................................................................................................... i Lista de Figuras ............................................................................................................. ii LISTA DE ABREVIATURAS .................................................................................... iii RESUMEN ................................................................................................................... iv ABSTRACT .................................................................................................................. v INTRODUCCIÓN ........................................................................................................ 1 1. Generalidades ..................................................................................................... 1 2. El virus de laringotraqueitis infecciosa aviar ..................................................... 3 3. Replicación del virus de laringotraqueitis infecciosa aviar................................ 4 4. Patología de la enfermedad causada por el virus de laringotraqueitis infecciosa aviar ........................................................................................................................... 5 5. Genoma viral del virus de laringotraqueitis infecciosa aviar ............................. 6 6. Glicoproteínas del virus de laringotraqueitis infecciosa aviar ........................... 7 7. Inmunología aviar contra el virus de laringotraqueitis infecciosa aviar: respuesta humoral y respuesta mediada por células .................................................. 9 8. Desarrollo de vacunas aviares contra el virus de laringotraqueitis infecciosa aviar y la necesidad por la implementación de nuevas estrategias para el desarrollo de éstas. Baculovirus: vehículo presentador de antígenos heterólogos ................... 12 PLANTEAMIENTO DE LA INVESTIGACIÓN ...................................................... 22 JUSTIFICACIÓN ....................................................................................................... 24 HIPÓTESIS ................................................................................................................. 26 OBJETIVO GENERAL .............................................................................................. 27 OBJETIVO ESPECÍFICOS ........................................................................................ 27 DISEÑO DEL ESTUDIO ........................................................................................... 28 METODOLOGÍA ....................................................................................................... 29 1. Componente: Bioinformático ........................................................................... 29 1.1 Construcción del mapa del vector in sílico ............................................... 29 1.2 Obtención de secuencia de ADN ensamblado in sílico ............................ 30 2. Componente: Sistema de expresión de proteínas en células de insecto (baculovirus) ............................................................................................................ 31 2.1 Preparación de células químicamente competentes Echerichia coli (E. coli) cepa DH5-alfa y DH10BacVSV .................................................................. 31 2.3 Purificación del plásmido “Ch-gpJ” ......................................................... 33 2.4 Transformación/Transposición del plásmido “Ch-gpJ” en células competentes DH10BacVSV de E. coli. ............................................................... 33 2.5 Transfección de células de insecto (Sf9) con el “bácmido - Ch-gpJ” recombinante ........................................................................................................ 35 2.6 Amplificación viral del baculovirus “Ch-Bv-gpJ” recombinante............ 36 2.7 Titulación viral por ensayo de placa. ....................................................... 36 2.8 Concentración de baculovirus recombinante “Ch-Bv-gpJ” ..................... 39 2.9 Expresión de baculovirus recombinante “Ch-Bv-gpJ” en células de insecto (Sf9) ......................................................................................................... 40 3. Componente: Ensayos serológicos e inmunológicos ....................................... 46 3.1 Ensayo de Sero-neutralización del baculovirus recombinante “Ch-Bv- gpJ” ………………………………………………………………...................46 3.2 Evaluación in vitro de baculovirus recombinante “Ch-Bv- gpJ” …………………………………………………………………………...48 4. Componente: Inmunización y desafío .............................................................. 51 4.1 Ensayo experimental de TCID50 para determinar la dosis infectiva media en cultivo celular para una cepa de campo de ILTV.............................. 51 4.2 Ensayo de inmunización y desafío en aves ............................................... 51 4.3 Evaluaciones de signos clínicos, moleculares, serológicas e inmunológicas. ..................................................................................................... 53 4.4 Datos estadístico ....................................................................................... 57 RESULTADOS.……………………………………………………………………..59 1. Componente: Bioinformático ........................................................................... 59 2. Componente: Sistema de expresión de proteínas en células de insecto (baculovirus) ............................................................................................................ 61 3. Componente: Ensayos serológicos e inmunológicos ....................................... 69 4. Componente: Inmunización y desafío .............................................................. 73 DISCUSIÓN ............................................................................................................... 86 CONCLUSIONES .................................................................................................... 100 RECOMENDACIONES ........................................................................................... 101 REFERENCIA BIBLIOGRÁFICA .......................................................................... 102 ANEXO Lista de Tablas Tabla 1. Grupos de aves para ensayo de inmunización y desafío (Pág. 51) Tabla 2. Descripción de eventos para ensayo de inmunización y desafío. (Pág. 52) Tabla 3. Puntaje de signos clínicos evaluados en días posteriores al desafío. (Pág. 76) Tabla 4. Evaluación de la carga viral en tejido traqueal en días posteriores al desafío. (Pág. 79) Tabla 5. Evaluación del título de anticuerpos en los días después de la inmunización y después del desafío. (Pág. 83) Tabla 6. Evaluación de la relación CD4/CD8 en los días después de la inmunización y después del desafío. (Pág. 84) Tabla A1. Referencia de genes de inserto (Bv-gpJ) (ANEXO) Tabla A2. Secuencia nucleotídica de genes del inserto (Bv-gpJ). (ANEXO) Tabla A3. Secuencia del plásmido donador pACEMam1. (ANEXO) Tabla A4. Características del plásmido donador pACEMam1 (Geneva Biotech, Suiza). (ANEXO) Tabla A5. Cuantificación de chIL12 (pg/mL) por ELISA en formato sándwich. (ANEXO) Tabla A6. Evaluación de signos clínicos, carga viral, título de anticuerpos y relación CD4/CD8. (ANEXO) Lista de Figuras Figura 1. Esquema del diseño del estudio. (Pág. 28) Figura 2. Esquema del Ensamblado del inserto “Bv-gpJ”. (Pág. 29) Figura 3. Mapa del plásmido donador pACEMam1 (Geneva Biotech, Suiza). (Pág. 30) Figura 4. Esquema de trabajo con el sistema de expresión de proteínas en célula de insecto (baculovirus). (Pág. 39) Figura 5. Secuencia “Bv-gpJ” ensamblada in sílico comprende secuencias del péptido señal (SP) de gp64, DsRed2, dominio transmembrana de gp64 y 6x-histidina (peso molecular aproximado 195.7KDa). (Pág. 59) Figura 6. Inserción del fragmento 1 de la secuencia “Bv-gpJ” en el plásmido donador pACEMam1 (Geneva Biotech, Suiza). (Pág. 60) Figura 7. Obtención de “Ch-gpJ” mediante la inserción del fragmento 2 en el plásmido donador que contiene el fragmento 1 de la secuencia “Bv-gpJ”. (Pág. 60) Figura 8. Digestión de plásmido recombinante “Ch-gpJ” con enzimas de restricción XbaI y SmaI. 1-8: plásmidos digeridos. 9: plásmido no digerido. 10: marcador de peso molecular LambdaDNA/HindIII. (Pág. 61) Figura 9. Placa LB agar que contiene colonias recombinantes de color blanco “bácmido-Ch-gpJ”. (Pág. 62) Figura 10. Secuenciamiento de 1050 pb perteneciente al gen que codifica gpJ. A: secuenciamiento utilizando el cebador forward. B: utilizando el cebador reverse. (Pág. 62) Figura 11. Células de insecto infectadas con baculovirus recombinante “Ch-Bv-gpJ” (4dpi) detectadas mediante microscopia de fuorescencia. A: Células de insecto no infectadas (control negativo). B, C y D: células de insecto infectadas (4dpi). dpi: días pos-infección. (Pág. 63) Figura 12. Detección mediante western blot de la cola de histidina (6x-histidina) presente en la secuencia “Ch-gpJ”. MOI: multiplicidad de la infección. dpi: días pos- infección. (Pág. 66) Figura 13. Detección mediante western blot de gp64 presente en la secuencia “Ch-gpJ”. A: 24 horas pdi. B: 48 horas dpi. C: 72 horas pdi. D: 96 horas pdi. 1: marcador meolecular PAGE MASTER protein standard plus (Genscript, EE.UU). Baculovirus recombinante “Ch-Bv-gpJ”: 2: resto celular; 3: lisado celular; 4: sobrenadante. Baculovirus no recombinante: 5: resto celular; 6: lisado celular; 7: sobrenadante. dpi: días pos-infección. (Pág. 67) Figura 14. Inmunofluorescencia directa para detección de 6xhis. Células de insecto infectadas con “Ch-Bv-gpJ”: (A) luz visible; (B) mCherry y DsRed2; (C) FITC; (D) mCherry, DsRed2 y FITC. Células de insecto no infectadas (control negativo): (E) luz visible. (F) FITC. (Pág. 69) Figura 15. Ensayo de seroneutralización en células de insecto infectadas a MOI de 0.1 de “Ch-Bv-gpJ” y baculovirus no recombinante utilizando sueros de aves infectadas con ILTV (A) y suero de aves SPF (B). IFR: intensidad de fluorescencia relativa. Las barras representan medianas. Kruskal-Wallis y Dunn test. (Pág. 71) Figura 16. Detección de chIL12 por ensayo de ELISA mediante estimulación con Ch- Bv-gpJ y Baculovirus no recombinante. Las barras representan las medianas y sus rangos. Kruskal-Wallis y Dunn test. CpG ODN (control positivo) a 40µM. No estimulado con Ch-Bv-gpJ MOI 0.05 (p=0.0505), MOI 0.1 (p=0.0004) y MOI 0.2 (0.0006). 48 horas: No estimulado con Ch-Bv-gpJ: MOI 0.05 (p=0.0127), MOI 0.1 (p=0.0002) y MOI 0.2 (p=0.0005); con baculovirus no recombinante MOI 0.05 (p=0.0325), MOI 0.1 (p=0.0130) y MOI 0.2 (p=0.0023); con CpG (p=0.0007). 72 horas: No estimulado con Ch-Bv-gpJ MOI 0.1 (p=0.0073) y MOI 0.2 (p=0.0013); con baculovirus no recombinante MOI 0.1 (p=0.0465) y MOI 0.2 (p=0.0030). (Pág. 73) Figura 17. Cinética de desarrollo de signos clínicos después del desafío. Grupo A: 105 UFP “Ch-Bv-gpJ”; Grupo B: 106 UFP “Ch-Bv-gpJ”; Grupo C: 107 UFP “Ch-Bv-gpJ”; Grupo D: 106 UFP baculovirus no recombinante; Grupo E: grupo control no inmunizado ni desafiado; Grupo F: grupo control de desafío. (Pág. 77) Figura 18. Carga viral en tráquea evaluada los días posteriores al desafío. Grupo A: 105 UFP “Ch-Bv-gpJ”; Grupo B: 106 UFP “Ch-Bv-gpJ”; Grupo C: 107 UFP “Ch-Bv-gpJ”; Grupo D: 106 UFP baculovirus no recombinante; Grupo E: grupo control no inmunizado ni desafiado; Grupo F: grupo control de desafío. (Pág. 80) Figura 19. Relación CD4/CD8 en los días posteriores al desafío. Grupo A: 105 UFP “Ch-Bv-gpJ”; Grupo B: 106 UFP “Ch-Bv-gpJ”; Grupo C: 107 UFP “Ch-Bv-gpJ”; Grupo D: 106 UFP baculovirus no recombinante; Grupo E: grupo control no inmunizado ni desafiado; Grupo F: grupo control de desafío. dpi: días pos- inmunización; dpd: días pos-desafío. Las barras representan medias y desviación estándar. (Pág. 85) LISTA DE ABREVIATURAS USDA Departamento de Agricultura de Estados Unidos ILTV Virus de laringotraqueitis infecciosa aviar IPTG Isopropil-β-D-1-tiogalactopiranósido SPF Libres de patógenos UFP Unidades formadoras de placa SENASA Servicio Nacional de Sanidad Animal OIE Organización Mundial de Sanidad Animal GaHV-1 Gallid herpesvirus de tipo 1 Gp Glicoproteína EHV-1 y 4 Herpesvirus de equino tipo 1 y 4 HVS-1 Herpesvirus simple de tipo 1 HVT-LT Herpesvirus de pavo-laringotraqueitis infecciosa aviar DHT Reacción de hipersensibilidad de tipo retardado FPV-LT Viruela aviar- laringotraqueitis infecciosa aviar TLR Receptores Toll-like ODN Oligodeoxinucleótidos CMV Citomegalovirus PBMC Células mononucleares de sangre periférica TCID50 Dosis infectiva media de tejido celular SP Péptido señal TMD Dominio transmembrana 6x-his Cola de histidine E. coli Echerichia coli Medio LB Medio Luria-Bertani MOI Multiplicidad de la infección HRP Peroxidase de rábano DAB 3,3´- Diaminobenzidina SDS-PAGE Electrophoresis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato sódico BSA Albúmina de suero bovino FITC Isotiocianato de fluoresceína IFR Intensidad de fluorescencia relative TMB 3,3´,5, 5´-tetrametilbenzidina LMH Células de hepatoma de pollo PCR Reacción en cadena de polimerasa qPCR PCR cuantitativo CpG Motivos CpG chIL12 Interleuquina 12 aviar NK Asesinos naturales mARN ARN mensajero AND Ácido desoxirribonucleico PBS Buffer fosfato salino TCO Vacunas producidas en cultivo celular CEO Vacunas producidas en embrión de pollo IBDV Virus de la enfermedad infecciosa de la bursa IBV Virus de bronquitis infecciosa aviar RESUMEN La presencia del virus de laringotraqueitis infecciosa aviar (ILTV) en la industria avícola peruana ha sido asociado a un incremento del 18% en la mortalidad de las aves ponedoras infectadas, así como a una disminución del 16% en la producción de huevos. El empleo de vacunas atenuadas contra ILTV ha sido asociado a brotes de infección en campo debido a que estos virus atenuados pueden recombinarse entre sí. En el presente trabajo se realizó la expresión de la glicoproteína J de ILTV en la envoltura viral de baculovirus (Ch-Bv-gpJ) el cual fue utilizado como un vehículo presentador del antígeno viral y como un potenciador de la respuesta inmune celular asociada a la inmunidad innata debido a sus propiedades como un agente adyuvante. Para los ensayos de inmunización y desafío se utilizaron 6 grupos (n=10 aves SPF de 1 día de edad por grupo) que fueron distribuidos de la siguiente manera (A) 105 UFP/ave de baculovirus recombinante “Ch-Bv-gpJ”; (B) 106 UFP/ave de baculovirus recombinante “Ch-Bv-gpJ”; (C) 107 UFP/ave de baculovirus recombinante “Ch-Bv- gpJ”; (D) 106 UFP/ave de baculovirus no recombinante; (E) grupo control no inmunizado ni desafiado y (F) grupo control sólo desafiado. Los resultados demostraron que a pesar que no se detectó presencia de anticuerpos en suero de aves inmunizadas con 106 UFP de baculovirus recombinante “Ch-Bv-gpJ” (grupo B) después del desafío, este grupo fue capaz de eliminar la replicación viral puesto que no se detectó carga viral en tráquea y se redujeron marcadamente las manifestaciones de los signos clínicos comparado con el grupo control sólo desafiado (grupo F). Esto demostró que el empleo de 106 UFP/ave de baculovirus recombinante “Ch-Bv-gpJ” es la dosis óptima frente a infecciones del virus de laringotraqueitis infecciosa aviar. Sin embargo, más evaluaciones son necesarias para establecer el rol protectivo de baculovirus recombinante “Ch-Bv-gpJ” en condiciones de campo. Palabras claves: ILTV, baculovirus, avicultura, vacuna, sistema inmune ABSTRACT Infectious laryngotracheitis virus (ILTV) in Peruvian poultry industry has been associated with 18% increased mortality in layer hens and 16% reduction of egg production. The use of live-attenuated vaccine against ILTV has been associated to infection outbreak in field due to attenuated viruses can recombine each other. In the present work, we expressed the glycoprotein J of ILTV on the baculovirus envelop which has used as an antigen display vehicle and as an adjuvant to enhance the cell-mediated response associated with innate immunity. For immunization and challenge assays, we included six 1-day-old SPF chicken groups (n=10 SPF chickens per group) (A) 105 PFU/bird of “Ch-Bv-gpJ” recombinant baculovirus; (B) 106 PFU/bird of “Ch-Bv-gpJ” recombinant baculovirus; (C) 107 PFU/bird of “Ch-Bv-gpJ” recombinant baculovirus; (D) 106 PFU/bird of no recombinant baculovirus; (E) neither immunized nor challenged group; (F) only challenged group. Despite the fact antibody titre was not detected in sera of immunized chicken with 106 PFU of “Ch-Bv-gpJ” recombinant baculovirus (B group) after challenge, this group was able to significantly eliminate viral replication due to no viral load was detected in trachea as well as it was observed a marked reduction of clinic signs in comparison with group F. It showed that 106 PFU of “Ch-Bv-gpJ” recombinant baculovirus is the optimal dose against ILTV infection. However, more evaluations are required to stablish the immune protective role of 106 PFU “Ch-Bv-gpJ” recombinant baculovirus in field conditions. Key words: ILTV, baculovirus, poultry, vaccine, immune system 1 INTRODUCCIÓN 1. Generalidades 1.1 Impacto económico del virus de laringotraqueitis infecciosa aviar (ILTV) Las grandes pérdidas económicas en la actividad avícola están relacionadas a la presencia de enfermedades de tipo viral y bacteriano que afectan a pollos y por ende a la producción avícola limitando su desarrollo y generando probablemente desabastecimiento a la población mundial. En 1925 se describió por primera vez al virus de laringotraqueitis infeccioso aviar como virus de “traqueolaringitis” proveniente de un brote de una granja en Rhode Island, Estados Unidos reportándose grandes pérdidas económicas debido al incremento en la mortalidad y reducción de la productividad (1). Posteriormente la presencia de este virus fue reportado en diferentes áreas avícolas no sólo de Estados Unidos sino también de Canadá en 1925 (2), Holanda en 1929 (3), Australia en 1935 (4), Suecia en 1940 (5), Polonia en 1948 (6), Finlandia en 1964 (7) entre otros (8). En los últimos 30 años distintos brotes han sido reportados en diferentes áreas avícolas en todo el mundo. La presencia del virus de laringotraqueitis infecciosa aviar fue reportado por primera vez en América del Sur en 1974 en Brasil (9) y en el 2002 se reportó un brote del virus de laringotraqueitis infecciosa en la región de Bastos en San Paulo, Brasil caracterizado por la 2 presencia de signos respiratorios así como el incremento en la mortalidad en gallinas ponedoras provenientes de 51 granjas (10). Asimismo, en noviembre del 2010 se produjo un gran brote del virus de laringotraqueitis infecciosa aviar en gallinas ponedoras de diferentes edades en el estado de Minas Gerais, Brasil que afectó a aproximadamente 8 millones de aves agrupadas en núcleos de 100 000 a 2 900 000 aves causando una mortalidad promedio de 1-6% y una morbilidad de 90% (11). A pesar que el Perú en 1996 fue considerado oficialmente por la Organización Mundial de Sanidad Animal (OIE) como un país libre del virus de laringotraqueitis infecciosa aviar (12), el Servicio Nacional de Sanidad Animal (SENASA) local reportó la detección de un caso de infección del virus de laringotraqueitis infecciosa aviar en aves de riña en el año 2008 y aplicó un plan para la prevención y erradicación de la laringotraqueitis infecciosa aviar mediante Resolución Jefatural N° 386- 2008-AG-SENASA (13). Actualmente el SENASA reporta de forma obligatoria y semanal los casos presuntivos de infecciones asociadas a el virus de laringotraqueitis infecciosa aviar de los cuales sólo analiza una muestra representativa y registra los resultados de dicha evaluación y el número de aves susceptibles a la enfermedad (14). Estudios publicados en revistas científicas locales sobre el impacto económico del virus de laringotraqueitis infecciosa aviar en el Perú han reportado disminución del 16% en la producción de huevos, así como un incremento del 18% en la mortalidad de las ponedoras infectadas (15). Otro 3 estudio comparativo en la presencia y ausencia del virus de laringotraqueitis infecciosa aviar en 35 mil pollos de engorde criados hasta los 49 días de edad reveló un incremento en la mortalidad de 3.51% y una reducción de la eficiencia productiva de 27.3% dando como resultado pérdidas totales que ascienden a S/. 88 805 nuevos soles por lote de aves (16). Por lo cual, el virus de laringotraqueitis infecciosa aviar representa un gran problema para la actividad avícola en el Perú y por ende a la población peruana dedicada a esta actividad como medio de trabajo. 2. El virus de laringotraqueitis infecciosa aviar 2.1 Etiología Clasificación El virus de laringotraqueitis infecciosa aviar (ILTV, siglas en inglés) es un Gallid herpesvirus de tipo I (GaHV-1) miembro del género Iltovirus, subfamilia alphaherpesviridae de la familia Herpesviridae del orden Herpesvirales (17). 2.2 Morfología Se detectó en cultivo celular de embriones de pollo que las nucleocapsides del virus de laringotraqueitis infecciosa aviar presentan partículas virales con simetría icosaédrica. La nucleocapside de forma hexagonal mide entre 80-100 nm de diámetro y está compuesta de 162 capsómeros huecos alargados. La partícula viral completa consiste de una envoltura viral 4 alrededor de la nucleocapside la cual tiene un diámetro entre 195-250 nm y presenta proyecciones superficiales finas conocidas como glicoproteínas (18, 19). 3. Replicación del virus de laringotraqueitis infecciosa aviar El virus de laringotraqueitis infecciosa aviar presenta formas características de penetración y salida de las células infectadas que se conservan en todos los herpesvirus. La penetración del virus a la célula blanco se da por fusión directa de la envoltura viral y la membrana celular. La nucleocapside desnuda llega a los poros del núcleo a través del movimiento de los microtúbulos celulares donde el genoma viral es liberado en el núcleo. La formación de las nuevas partículas virales empieza con el ensamblaje de sus nucleocapsides en el núcleo, desde donde salen al citoplasma mediante gemación a través de la membrana interna nuclear, en donde adquiere una envoltura primaria, hacia el espacio perinuclear. Esta envoltura primaria posteriormente permite la fusión de la nucleocapside con la membrana externa del núcleo hacia el citoplasma adquiriendo aparentemente una segunda envoltura con alto contenido de tegumento resultando en partículas virales con envoltura localizadas en vesículas derivadas del aparato de Golgi para ser finalmente liberadas de la célula (20, 21). La transcripción y replicación viral de los herpesvirus se realiza en el núcleo de la célula hospedera. El virus de laringotraqueitis infecciosa aviar al igual que otros herpesvirus presenta 3 clases de genes los cuales han sido clasificados 5 según el intervalo de tiempo en el cual se encuentran activos o expresados. Genes inmediatamente tempranos (IE) agrupan genes que codifican factores de transcripción. Genes tempranos (E) agrupan genes que participan en el metabolismo y replicación viral. Genes tardíos (L) agrupan genes que codifican proteínas que participan en el ensamblaje viral (22, 23). 4. Patología de la enfermedad causada por el virus de laringotraqueitis infecciosa aviar El órgano blanco principal para el desarrollo de la infección causada por el virus de laringotraqueitis infecciosa aviar es el tracto respiratorio. El tejido epitelial de la tráquea como la laringe son los tejidos de preferencia que se ven afectados siendo en menor proporción las membranas mucosas como la conjuntiva, sacos aéreos y el tejido pulmonar. La replicación activa del virus ocurre sólo durante la primera semana la cual puede extenderse hasta 10 días después de la infección. Usualmente los pollos infectados logran recuperarse dentro de los 7 a 10 días después de la primera manifestación de los signos clínicos, este periodo coincide con la replicación activa del virus a nivel de tráquea. Desde el día 10 hasta las 4 semanas después de haber ocurrido la infección en tráquea el virus entra en fase de latencia invadiendo los tejidos nerviosos y estableciéndose en el ganglio trigémino. La reactivación del virus puede darse como resultados de situaciones de estrés como comienzo de postura, cambios en temperatura entre otros (24). 6 El virus de laringotraqueitis infeciosa aviar se transmite naturalmente mediante el tracto respiratorio superior, vía aérea y ocular; siendo las fuentes de transmisión: las aves clínicamente infectadas, animales portadores, polvo contaminado, escarabajos, agua y desechos de aves (25). Esta enfermedad se caracteriza por el hallazgo de sangre, restos mucosos y exudados amarillos caseosos en la tráquea que conllevan a la muerte por asfixia. La forma sub-aguda de la enfermedad está caracterizada por presentar zonas hemorrágicas en la tráquea, edemas y congestión en el epitelio de la conjuntiva asi tambien en los senos infraorbitarios. Además de signos clínicos generales como congestión nasal y ocular, tos, jadeos, estornudos, expectoración de sangre y sustancias mucosas (24, 26). 5. Genoma viral del virus de laringotraqueitis infecciosa aviar El material genético del virus de laringotraqueitis infecciosa aviar es un ADN lineal de doble cadena del tipo herpesvirus D que está compuesta de una región larga única (UL) y una región corta única (US) que presenta dos orientaciones isoméricas (27) asimismo la región única corta está flanqueada por una secuencia repetitiva idéntica interna y terminal (28). El primer genoma completamente secuenciado fue de la cepa vacunal SERVA de 152 628 pares de bases con un contenido de guanina-citosina de 48% y 80 marcos de lectura abiertos (ORF, open reading frame) de los cuales 65 están localizados en la región UL, 9 en la región US y 3 en las secuencias repetitivas (29). 7 El orden de los genes dentro del genoma del virus es similar a otros alphaherpesvirus; sin embargo, cambios a nivel genómico propios de este virus y homólogos al Psittacid herpesvirus han sido identificados: translocación del ORF UL47 de la región UL a la US entre US3 y US4 (30); inversión interna en la región UL comprendida desde UL22 a UL44 (30) y la presencia de 5 ORFs (A, B, C, D y E) localizados al extremo 5’ del gen UL45 (30, 31) así como la presencia de UL0 y UL-1 localizados en el extremo 5’ de UL1 (32). 6. Glicoproteínas del virus de laringotraqueitis infecciosa aviar 6.1 Caracterización de las glicoproteínas virales Como alphaherpesvirus, el virus de laringotraquitis infecciosa aviar presenta glicoproteínas en la envoltura viral que son inmunogénicas y los principales blancos de la respuesta inmune humoral y celular en el hospedero (33-35). Estudios previos realizados en herpes virus simple permitieron identificar glicoproteínas propias del virus de laringotraqueitis infecciosa aviar. Así se ha predecido que 12 glicoproteínas serian codificadas por el virus de laringotraqueitis infecciosa aviar, sin embargo de estas sólo algunas han sido estudiadas (36). La glicoproteína B es necesaria para la penetración del virus a la célula y está altamente conservada en los herpesvirus (37), la deleción de la glicoproteína I y E está asociada a la incapacidad del virus de transmitirse de una célula a otra (38). Asimismo, la deleción de la glicoproteína C está relacionada a un retraso en la penetración del virus a la célula observándose una reducción en el 8 diámetro de las placas formadas (36). La glicoproteína secretada G está asociada a la evasión viral del sistema inmune del hospedero debido a que esta interactúa y bloquea a las quimioquinas (39). 6.2 Glicoproteina J A pesar que los estudios realizados sobre la glicoproteína J son muy limitados se sabe que es la principal proteína de superficie del virus de laringotraqueitis infecciosa aviar y fue inicialmente llamada glicoproteína 60K (gp60) debido a que fue detectada por anticuerpos monoclonales con un peso molecular de 60 KDa (35), pero, debido a que el gen que la codifica ocupa una posición homóloga al gen US5 localizado en el ORF5 de la región US del genoma del herpes virus simple-1 (HSV-1) esta proteína fue denominada glicoproteína J (gpJ). Sin embargo, gpJ del virus de laringotraqueitis infecciosa aviar comparte una mayor identidad aminoacídica con su proteína respectiva en herpes virus de caballo-1 y 4 (EHV-1 y EHV-4) de 24-26% en comparación con HSV-1 (40). Un estudio posterior detectó la presencia de bandas de aparentes pesos moleculares de 85, 115, 160 y 200 kDa no observándose una banda de 60 kDa y una microscopía inmunoelectrónica reveló la presencia de esta glicoproteína en la envoltura viral de laringotraqueitis infecciosa aviar. Además, sueros de pollo infectados naturalmente o experimentalmente con el virus de laringotraqueitis infecciosa aviar y los anticuerpos monoclonales 9 producidos a partir de virus purificados fueron capaces de reconocer gpJ mostrándose así su alta inmunogenicidad (41). Posteriormente se demostró que la proteína de 85KDa provenía de la secuencia cDNA que sufrió corte y empalme del gen que codifica a gpJ y que las proteínas obtenidas de 115, 160 y 200 kDa son producto de la secuencia de mRNA que no sufrió corte y empalme no obstante estas secuencias sufrieron modificaciones traduccionales (40). Estudios basados en la generación de virus que presentan delecion de gpJ demuestra que el título viral en los sobrenadantes de cultivos con células infectadas disminuyó marcadamente por lo cual indica que gpJ tiene un rol importante durante la salida del virus de la célula (42). 7. Inmunología aviar contra el virus de laringotraqueitis infecciosa aviar: respuesta humoral y respuesta mediada por células Análogamente a otros animales la maduración de las células T en aves se realiza en el timus, sin embargo, a diferencia de otras especies, las aves presentan un órgano linfoide particular conocido como bursa de Fabricio, localizada en la región del proctodeo de la cloaca, la cual es esencial para la amplificación y diferenciación de células B progenitoras y por ende para la producción de anticuerpos (respuesta humoral) (43, 44). La remoción quirúrgica de la bursa de Fabricio o bursectomía durante el desarrollo temprano embrionario demostró un alto daño del sistema inmune humoral, no obstante la bursectomía durante el desarrollo tardío embrionario 10 mostró una reducción marcada del número de linfocitos B circulantes así como una ausencia total en la producción de anticuerpos (43). Otro estudio realizado en pollos bursectomizados a las 2, 5 y 10 semanas de edad y posteriormente expuestos a Salmonella typhimurium y células sanguíneas de oveja mostró que cuanto más tardíamente eran los pollos bursectomizados la producción de anticuerpos no se veía afectada a pesar de ser expuestos constantemente al antígeno (45). Estudios realizados sobre el rol de la respuesta humoral en infecciones del virus de laringotraqueitis infecciosa aviar no detectaron anticuerpos en suero de aves que habían sido sometidas a bursectomía y tratados con ciclosfosfamida el primer día de edad, posteriormente vacunados con la cepa australiana SA2 ILTV y desafiados con cepa silvestre del virus de laringotraqueitis infecciosa aviar. A pesar de la no producción de anticuerpos debido a la ablación de la respuesta humoral no hubo reducción de la respuesta protectiva de la vacuna por lo cual se concluyó que probablemente la respuesta inmunológica inducida por la vacuna es independiente de la inducción de la respuesta humoral. De la misma manera se evalúo la inmunidad pasiva mediante la inoculación de suero hiper-inmune contra el virus de laringotraqueitis infecciosa aviar en pollos que fueron posteriormente desafiados detectándose anticuerpos circulantes y observándose signos clínicos característicos de la enfermedad. Dichos resultados sugieren que probablemente la presencia de anticuerpos maternales contra el virus de laringotraqueitis infecciosa aviar como inmunidad pasiva en pollos recién nacidos no ejerza ninguna protección o interferencia contra el 11 virus de laringotraqueitis infecciosa aviar (46). Asimismo la ausencia de anticuerpos en las áreas mucosas de la tráquea en pollos bursectomizados posteriormente vacunados y desafiados no evidenció la presencia de infección en tráquea mediante inmunofluorescencia como anteriormente se mencionó que los anticuerpos de áreas mucosas podrían tener un rol muy importante en la recuperación de la infección (47). Un estudio posterior señala que una fuerte producción de anticuerpos en pollos inmunizados con la vacuna vectorizada HVT-LT que expresa glicoproteínas del virus de laringotraqueitis infecciosa aviar no puede ser interpretada como una medida de protección sino como una indicación de recepción de la vacuna por el pollo y como una evidencia de la antigenicidad de las glicoproteínas expresadas por el vector puesto que a pesar de la producción de anticuerpos se detectó la presencia de virus en tráquea y ligera disminución de signos clínicos posterior al desafío (48). Además, estudios previos señalan la alta inmunogenicidad de las glicoproteínas por su capacidad de ser reconocidas por anticuerpos monoclonales y por anticuerpos presentes en el suero de aves y conejos infectados con el virus de laringotraqueitis infecciosa aviar (35). Adicionalmente, York J. y Fahey K. demostraron que la fracción de glicoproteínas del virus de laringotraqueitis infecciosa aviar obtenidas mediante immunoprecipitación con anticuerpos monoclonales específicos fue capaz de inducir una reacción de hipersensibilidad de tipo retardado (DTH) en el zarzo de pollo previamente inmunizados contra este virus enfatizando así una respuesta inmune mediada por células (34). 12 Posteriormente, se reportó que la glicoproteína G (gpG) de naturaleza secretada del virus de laringotraqueitis infecciosa aviar tiene la capacidad de interactuar con quimioquinas recombinantes de origen animal y humano. La interacción de gpG con quimioquinas representa probablemente un mecanismo de evasión del sistema inmune del hospedero por parte del virus. La deleción de gpG del virus de laringotraqueitis infecciosa aviar permitió el reclutamiento de heterófilos, células homólogas a los neutrófilos en mamíferos (49), al área de infección (tráquea) así como el incremento local en el número de linfocitos CD4 y CD8 y una disminución en el número de linfocitos B y por consiguiente una reducción en la producción de anticuerpos. Así la deleción de gpG altera la respuesta inmune del hospedero comparado con una respuesta inmune ocasionada por la infección de un virus completo (sin deleción) resaltándose la importancia de gpG en estadíos tempranos de la infección y por ende en la respuesta innata del hospedero (38, 50). Coppo y colegas describieron a gran detalle que gpG tiene una alta afinidad por quimioquinas inhibiendo la migración y activación de células inmunes especializadas. De esta manera el virus de laringotraqueitis infecciosa aviar evade la respuesta inmune del hospedero modulando la respuesta inmune celular e innata favoreciendo la respuesta humoral y favoreciendo la supervivencia del virus (39). 8. Desarrollo de vacunas aviares contra el virus de laringotraqueitis infecciosa aviar y la necesidad por la implementación de nuevas estrategias 13 para el desarrollo de éstas. Baculovirus: vehículo presentador de antígenos heterólogos 8.1 Problemática del desarrollo de vacunas contra el virus de laringotraqueitis infecciosa aviar Desde 1930, después del primer reporte de la presencia del virus de laringotraqueitis infecciosa aviar en Estados Unidos se ha utilizado virus vivos modificados de baja virulencia o atenuados como cepas vacunales (51). La modificación de dichos virus fue realizada mediante pasajes sucesivos en cultivos celulares cuya atenuación fue demostrada mediante la formación de lesiones atípicas en la membrana corioalantoidea de embriones de pollo y la reducción de la virulencia en aves susceptibles (52). El uso de enzimas de digestión de ADN (endonucleasas de restricción) permitió identificar patrones de fragmentos de ADN (pesos moleculares) obtenidos a partir de la digestión de ADN viral, dichos patrones fueron empleados para determinar que cepas aisladas de campo presentaron patrones correspondientes a cepas vacunales, de los resultados se concluyó que las cepas usadas como vacunas serían la causa del brote del virus de laringotraqueitis infecciosa aviar como resultado de la reversión a la virulencia parental (53). No obstante, debido a que las cepas vacunales provienen de aislados de campo se consideró que el análisis de ADN mediante enzimas de restricción no permitía distinguir a las diferentes cepas a pesar que éstas presentaban marcadas diferencia en patogenicidad (51). 14 Asimismo, se propuso que probablemente los brotes causados por cepas vacunales fueron originados debido a la insuficiente atenuación que podría sumarse a las condiciones de los galpones (54). Sin embargo, un estudio posterior reportó que cepas usadas como vacunas obtenidas por pasajes sucesivos en embriones de pollo (CEO, chick embryo origen) demostraron mayor virulencia que cepas obtenidas por pasajes sucesivos en cultivo celular (TCO, tissue culture origin) cuando éstas son transmitidas de ave a ave (55) motivo por el cual la transmisión de cepas vacunales de pollos vacunados a pollos no vacunados podría significar un pasaje sucesivo del virus y un incremento en la virulencia de la cepa. Posteriormente se identificaron 2 puntos de recombinación mediante el alineamiento de genomas del virus de laringotraqueitis infecciosa aviar. Dichos genomas fueron obtenidos mediante secuenciamiento de última generación empleando genomas provenientes de cepas virulentas (clase 8 y 9) recientemente detectadas en Australia y asociadas a brotes causantes del incremento en la mortalidad de hasta 17.6% así como genomas de cepas vacunales de origen australiano SA2 y A20 (Pfizer, Australia) y de origen europeo SERVA (Intervet). El alineamiento de genomas demostró que la mayoría de secuencias pertenecientes a las cepas virulentas (clase 8 y 9) fueron altamente idénticas a SERVA. Se detectó además polimorfismos de nucleótidos únicos (SNP) en distintas regiones únicas para cada clase, las secuencias de estas regiones fueron altamente idénticas con las cepas SA2 15 y A20 identificándose recombinaciones entre cepas vacunales australianas y europeas dando como resultado cepas emergentes virulentas (clase 8 y 9) (56), asimismo el uso de herramientas bioinformáticas permitió detectar puntos de recombinación en la secuencia única larga así como en la región invertida repetitiva del genoma (57). Sin embargo, un estudio posterior realizado en Estados Unidos determinó que las cepas virulentas 63140 y 81658 de origen norteamericano eran muy cercanas a las cepas vacunales CEO y TCO respectivamente por lo cual no hay evidencia de eventos de recombinación entre éstas cepas vacunales, así se propuso que dicha virulencia probablemente pueda surgir mediante otro mecanismo diferente a la recombinación homóloga comparado con lo descrito en cepas virulentas australianas (58). La búsqueda de nuevas estrategias para el desarrollo de vacunas contra el virus de laringotraqueitis infecciosa aviar que permitan la inducción de una respuesta inmune protectiva evitando el uso de vacunas atenuadas que puedan revertirse es de vital importancia. El uso de genomas de virus como vectores portadores de antígenos virales que afectan a pollos ha sido ampliamente explorado en la industria avícola (59-63). En 1992 se publicó un estudio basado sobre el desarrollo de vacunas avícolas usando cepas recombinantes de herpesvirus de pavo (HVT, herpesvirus of turkey) que contenían secuencias codificantes de las proteínas de hemaglutinina-neuraminidasa y de fusión del virus aviar de 16 Newcastle insertadas en genes no esenciales de HVT (64). La expresión de la glicoproteína B, proteína altamente conservada y escencial para la adhesión y penetración del virus a la célula, del virus de laringotraqueitis infecciosa aviar fue desarrollada usando al herpesvirus de pavo como vector demostrándose su eficacia como vacuna en pollos comerciales y libres de patógenos. Dicha eficacia en pollos comerciales fue evaluada mediante desafío a las 21 y 35 días de edad de pollos vacunados in ovo observándose 67% (10/15) y 87% (13/15) de pollos que no desarrollaron signos clínicos respectivamente (60). Sin embargo, debido a que el virus HVT está asociado a células resulta muy costosa la producción debiendo ser éstas transportadas y preservadas en nitrógeno líquido (59). Asimismo el uso del genoma del virus fowlpox (FPV) como vector para la expresión de la glicoproteína B del virus de laringotraqueitis infecciosa aviar en pollos desafiados a los 35 días de edad demostró 100% de protección identificándose la ausencia de signos clínicos y 85% de protección para pollos inmunizados con la vacuna comercial Nobilis ILT (62). No obstante se ha reportado que la respuesta inmune específica es menor comparada con el uso de vacunas atenuadas siendo necesario una dosis de refuerzo (65) e incluso se sugirió el uso de éstas en combinación con vacunas convencionales con el propósito de optimizar la respuesta inmune (59). 17 Finalmente, un estudio comparativo de vacunas atenuadas y vectorizadas (HVT-LT y FPV-LT) demostró que las vacunas atenuadas, administradas a los 14 días de edad, reducen significativamente signos clínicos propios de la enfermedad causada por el virus de laringotraqueitis aviar tanto en pollos comerciales vacunados y desafiados a los 35 y 57 días en comparación con las vacunas vectorizadas. No obstante, los pollos vacunados con HVT-LT (Innovax ILT, Intervet) fueron más efectivos que FPV-LT (Vectormune, Ceva), vacunas administradas in ovo y subcutáneamente el primer día de edad, porque redujeron los signos clínicos y carga viral en pollos desafiados a los 57 días en comparación de los pollos desafiados a los 35 días (48) proponiéndose la co-administración de inmunomoduladores que permitan aumentar la respuesta inmune lo cual nos sugiere que la respuesta inmune del pollo ante la presencia del virus de laringotraqueitis infecciosa aviar este siendo inducida aproximadamente 8 semanas después de la vacunación lo que realmente representa una inducción deficiente debido al ciclo de vida de pollos comerciales. No obstante, los autores sugieren que la transferencia de anticuerpos maternales generados contra FPV a pollos haya sido probablemente un factor que impidió una respuesta protectiva para el caso de FPV-LT (48). Si bien se ha reportado que el uso de vacunas inactivadas induce una buena protección en pollos inmunizados y posteriormente desafiados (66), los costos de producción de la vacuna resultan ser muy altos (67). 18 8.2 Necesidad por la generación de nuevas vacunas contra el virus de laringotraqueitis infecciosa aviar. Baculovirus: vehículo presentador de antígenos heterólogos Debido a la falta de correlación entre el título de anticuerpos y la respuesta inmune protectiva, se hace énfasis en la respuesta inmune celular (26) y en las células efectoras de la inmunidad innata (39). Los monocitos conforman aproximadamente entre el 5-10% de células leucocitarias periféricas de sangre en pollos pero esto puede variar dependiendo del linaje del pollo (43). Estas son parte de la primera línea de defensa las cuales migran a diferentes tejidos para diferenciarse en macrófagos (68). Los receptores Toll-like receptors (TLRs) forman parte del grupo de receptores pattern-recognition receptors (PRRs) que tienen la capacidad de reconocer un amplio número de ligandos debido a que estos ligandos comparten patrones moleculares en común. Estos TLRs se encuentran localizados en macrófagos, células B (69) y heterófilos aviares (70). Estudios previos señalan que TLR21 de aves (chTLR21), homólogo TLR9 de mamíferos, esta presente en macrófagos, siendo por ello capaces de modular la activación celular y producción de citoquinas (71). ChTLR21 está localizado en el retículo endoplasmático cuya activación sólo ocurre cuando estos son translocados a endolisosomas. Al igual que TLR9, chTLR21 tiene la capacidad de reconocer islotes de CpG no metilados (72) de origen viral y bacteriano (73), así se demostró que CpG 19 oligodeoxinucleótidos (ODN) tiene la capacidad de estimular la producción de IFN-ɣ inductor de la respuesta inmune de tipo Th1 (71). De la misma manera se reportó que aves desafiadas con virus de influenza aviar y previamente inoculadas con CpG ODN, ligando de chTLR21, fueron capaces de reducir significativamente la diseminación viral y promover la expresión de mRNA de IFN- ɣ en pulmón (73). Otro estudio reportó el incremento en la expresión de IL-1β, IFN-ɣ, IFN-β y IFR-7 así como el aumento de la producción de oxido nítrico (NO) en la línea celular de macrófagos aviares MQ-NCSU estimulados por CpG ODN 1826, además de la reducción del título viral en macrófagos estimulados con CpG ODN 1826 y posteriormente infectados con virus de influencia aviar. Este incremento en la expresión de estos genes se infiere como un producto de la estimulación de CpG ODN con los receptores TLR presentes en la membrana del macrófagos. Dicha interacción promueve la activación de macrófagos fortaleciendo la respuesta inmune innata y reduciendo el título viral (74). Además un estudio realizado en bronquitis infecciosa aviar propone el uso de baculovirus como agente inmunomodulador capaz de interactuar con receptores TLR promoviendo el incremento en la expresión chIL12, ChIL6 e IFN-ɣ (75). Asimismo, otro estudio posterior detallada la inducción de la expresión de chIL12 modulado por chTLR21 en macrófagos de aves expuestas a baculovirus (76). 20 Del estudio de Han y colegas se evidencia que tanto CpG y baculovirus son probablemente ligandos para chTLR21, ambos ligandos tienen la propiedad de estimular el sistema inmune de aves mediante la inducción de citoquinas que permiten la polarización de la respuesta inmune de tipo Th1 (76). La versatilidad de baculovirus como un vehículo presentador de antígenos que tiene la capacidad de transducirse en células diferentes a la de su huésped natural como son las células de insecto hace de este sistema de expresión de proteínas muy ventajoso y útil por ser además inocuo debido a que si bien no puede replicarse en otras células diferentes a su huésped se ha reportado que genes que están bajo el control del promotor de citomegalovirus (CMV) pueden ser expresados en células de mamíferos y en células de fibroblasto de embrión de pollo (77). Además, el uso estratégico de una de las fases de replicación (replicación bifásica) conocida como virus de brote permite el uso de la glicoproteína 64 (gp64) presente en la envoltura viral de baculovirus durante las primeras 16 a 24 horas pos- infección facilitando la fusión e incorporación de una proteína de interés para su expresión en la envoltura de baculovirus permitiendo su exposición y fácil reconocimiento al sistema inmune del huésped (78-80). gp64 presenta una secuencia rica en lisinas mediante la cual se darían interacciones electrostáticas con receptores de células distintas a las células de insecto que contienen sulfatos de heparina (81), no obstante, aún se desconoce el mecanismo exacto (82). Es necesario mencionar que las proteínas producidas usando este sistema de expresión presentan un mejor 21 plegamiento comparado con el uso de células bacterianas y que si bien las modificaciones pos-traduccionales están presentes en las proteínas producidas estas modificaciones no son tan complejas como las modificaciones pos-traduccionales en células de mamíferos (83). Estas características junto a sus propiedades como adyuvante resaltan aún su aplicación como agente inmunomodulador del sistema inmune (84). La generación de nuevas vacunas que permitan potenciar la respuesta inmune celular son de vital importancia para combatir la enfermedad ocasionada por el virus de laringotraqueitis infecciosa aviar que depende mucho de la estimulación de la inmunidad celular del huésped es por ello que este trabajo propone a baculovirus, virus de célula de insecto, como un agente adyuvante que potencia la respuesta celular mediante la inducción de citoquinas paralelo al reconocimiento de la glicoproteína J por el sistema inmune adaptativo cuyas perspectivas se ven reflejadas en los diferentes trabajos publicados en el uso de baculovirus como un vehículo presentador de antígenos (61, 85-88). 22 PLANTEAMIENTO DE LA INVESTIGACIÓN La enfermedad viral causada por el virus de laringotraqueitis infecciosa aviar en la industria avícola representa grandes pérdidas económicas no sólo a nivel local sino también a nivel internacional provocando incrementos tanto en la mortalidad como en la morbilidad de pollos resultando en el alza de los productos derivados como los huevos (15, 16). El desarrollo de diversas estrategias para el control de la enfermedad nos ha mostrado a través de los años que el virus de laringotraqueitis infecciosa aviar por ser un alphaherpesvirus tiene la capacidad de recombinarse (89), evidencia de ello fue el uso de vacunas atenuadas obtenidas por pasajes sucesivos (cepas vacunales) que puede convertirse en focos de infección y diseminación al darse recombinación entre cepas vacunales resultando los virus de la progenie ser aún más virulentos (56). Del mismo modo, el uso de vacunas vectorizadas que expresan genes propios del virus de laringotraqueitis infecciosa aviar demostraron no ser capaces de inducir una respuesta inmune temprana (48) lo cual podría favorecer el desarrollo de la enfermedad en los primeros días de edad del ave. Sin embargo, debido a que una producción de anticuerpos no puede interpretarse como una respuesta inmune protectiva sino como un marcador de alta antigenicidad de las glicoproteínas virales (48) se plantea que la respuesta inmune innata y mediada por células tendrían un rol relevante como medio de defensa del hospedero ante una infección viral, apoyándose esta idea en la descripción detallada de la existencia de la glicoproteína G secretada de origen viral la cual bloquea la actividad biológica de las 23 quimioquinas mediante su interacción con éstas, evitando el reclutamiento de células especializadas del sistema inmune al área de infección permitiendo así la replicación viral (39). Por lo cual este estudio busca el uso de estrategias diferentes que permitan estimular la respuesta celular asociada a la inmunidad innata promoviendo la activación de células efectoras capaces de controlar el desarrollo de la enfermedad causada por el virus de laringotraqueitis infecciosa aviar. 24 JUSTIFICACIÓN La necesidad por nuevas vacunas que permitan no sólo estimular la respuesta humoral mediante la producción de anticuerpos, sino también mediante la activación de células especializadas del sistema inmune que induzcan la producción de citoquinas que refuecen la respuesta inmune mediada por células así como la estimulación de la inmunidad innata se enmarca dentro de la problemática del virus de laringotraqueitis infecciosa aviar puesto que ha sido reportado que la producción de anticuerpos no es una evidencia del desarrollo de una respuesta protectiva durante la enfermedad provocada por este virus en las aves Por ello se plantea el uso de baculovirus como vehículo presentador de antígenos de interés capaz de ser reconocido e interactuar con células efectoras de la inmunidad innata. Además, baculovirus se caracteriza por ser un agente inmunomodulador (adyuvante) ya que estudios previos demostraron que puede inducir la producción de citoquinas de tipo Th1 como IFN-ɣ y la producción de citoquinas responsables de la polarización de la respuesta inmune de tipo Th1 como IL12 en líneas celulares de macrófagos reforzando de esta manera la inmunidad innata como primera línea de defensa del hospedero. La interacción de baculovirus con células presentadoras de antígeno mediante los receptores TLR permitirá la activación de otras células especializadas del sistema inmune innato como células NK potenciando la respuesta inmune innata para el control y reducción de la replicación viral y promoviendo el desarrollo de una consistente respuesta inmune adaptativa capaz de proteger a las aves de futuras infecciones. 25 La utilización del sistema de expresión de proteínas en células de insecto (baculovirus) en el desarrollo de potenciales vacunas a ser usadas en la industria avícola permitirá evitar las consecuencias del uso de vacunas atenuadas, que pueden recombinar y generar reacciones pos-vacunales; además, baculovirus es inocuo a otras células diferentes de su huésped natural puesto que no puede replicarse por lo cual no generaría reacciones adversas en las aves inmunizadas. Este estudio contribuiría al desarrollo de vacunas en el campo veterinario basadas en baculovirus como vehículo presentador de antígenos heterólogos resaltando su capacidad de estimular el sistema inmune de aves. 26 HIPOTESIS Baculovirus recombinante que expresa la glicoproteína J en su envoltura viral inducirá una respuesta inmune protectiva ante desafíos con el virus de laringotraqueitis infecciosa aviar. 27 OBJETIVO GENERAL Determinar el rol protectivo en aves SPF de un baculovirus recombinante que expresa la gpJ en su envoltura viral mediante ensayos de desafío frente al virus de laringotraqueitis infecciosa aviar. OBJETIVO ESPECÍFICOS 1. Ensamblaje in sílico del plásmido donador recombinante “Ch-gpJ” mediante el uso de herramientas bioinformáticas. 2. Expresión y producción de baculovirus recombinante “Ch-Bv-gpJ” en células de insecto (línea celular Sf9). 3. Estimulación in vitro de células mononucleares de sangre periférica de pollo mediante exposición a baculovirus recombinante “Ch-Bv-gpJ”. 4. Evaluación in vivo de aves inmunizadas con baculovirus recombinante “Ch-Bv- gpJ” y posteriormente desafiadas con el virus de laringotraqueitis infecciosa aviar. 28 DISEÑO DEL ESTUDIO Figura 1. Esquema del diseño del estudio Construcción del mapa del vector in sílico (SNAPGENE) Obtención del ensamblado Laboratorios Genscript, EE.UU Expresión de baculovirus recombinante “Ch-Bv-gpJ” usando el sistema de expresión de proteínas en células de insecto Ensayo de seroneutralización y estimulación de baculovirus recombinante “Ch-Bv-gpJ” en PBMC de aves Dosis infectiva media en cultivo celular (TCID50) Inmunización y desafío Evaluación celular (citometría de flujo) Evaluación serológica (ELISA) Evaluación de signos clínicos Ensayo de inmunofluorescencia en células de insecto usando baculovirus recombinante “Ch-Bv-gpJ” Finalidad: obtener el ensamblado de los genes fusionadas in sílico Finalidad: determinar la capacidad de baculovirus recombinante “Ch-Bv-gpJ” de evocar una respuesta inmune in vitro Finalidad: determinar la localización de nuestro inserto “Bv-gpJ” en la célula de insecto para su incorporación a baculovirus a la salida de la célula infectada Análisis estadístico Finalidad: sintetizar los genes fusionados in sílico y clonar en el plásmido donador pACEMam1 Finalidad: expresión del baculovirus recombinante “Ch-Bv-gpJ” Finalidad: determinar la capacidad de baculovirus recombinante “Ch-Bv-gpJ” de evocar una respuesta inmune in vivo Evaluación de la carga viral ILTV (qPCR) 29 METODOLOGÍA 1. Componente: Bioinformático 1.1 Ensamblaje in sílico del plásmido donador recombinante “Ch-gpJ” (mapa del vector) El ensamblaje in sílico se realizó con el programa bioinformático SnapGene® (V2.3.5, 2010, EE.UU.) (www.snapgene.com). La secuencia nucleotídica de la glicoproteína J (gpJ) de ILTV fue flanqueada en el extremo 3’ por la secuencia del péptido señal (SP) y en el extremo 5’ por la secuencia del dominio transmembrana (TMD) de la glicoproteína 64 (gp64) de baculovirus. Además, la secuencia nucleotídica gpJ se fusionó el gen reportero DsRed que nos permitió monitorear la expresión y localización de gpJ. Estas secuencias fusionadas in sílico a las cuales llamamos “Bv-gpJ” (Fig. 2) fueron sintetizadas por fragmentos en plásmidos pUC57 (fragmento 1: SPgp64-DsRed-TMDgp64-6xhis; fragmento 2: gpJ) en Laboratorios Genscript, EE.UU. (Anexo Tab. A1 y A2). Figura 2. Esquema del Ensamblado del inserto “Bv-gpJ” SPgp64 DsRed gpJ TMDgp64 NH2- -COOH 6 xh is ta g 30 1.2 Obtención del plásmido donador recombinante “Ch-gpJ” El fragmento 1 de la secuencia “Bv-gpJ” fue clonada en el plásmido donador pACEMam1 (Geneva Biotech, Suiza) (Fig. 3 y Anexo Tab. A3 y A4) usando las enzimas de digestión EcoRI y HindIII y luego el fragmento 2 fue clonado usando XbaI y SmaI generando un nuevo plásmido donador recombinante llamado “Ch-gpJ” en donde la secuencia “Bv-gpJ” estuvo bajo el control del promotor temprano de citomegalovirus (CMV). Figura 3. Mapa del plásmido donador pACEMam1. (Geneva Biotech, Suiza) pACEMam1 3443 bp PromGenCDSI-CeuI LoxP Tn7R Ori ColE1 Tn7L CMV EC Not I (2860) Rsr II (2809) AvrII (3255) Pme I (2091) BstZ17I (3263) Nru I (2109) SpeI (2096) SpeI (2150) 31 2. Componente: Sistema de expresión de proteínas en células de insecto (baculovirus) 2.1 Preparación de células químicamente competentes Echerichia coli (E. coli) cepa DH5-alfa y DH10BacVSV (90) 2.1.1 Se sembró por agotamiento una colonia de E. coli de la cepa DH5- alfa en una placa que contiene agar-LB (Luria-Bertani) sin antibiótico, del mismo modo se sembró una colonia de E. coli de la cepa DH10BacVSV (Geneva Biotech, Suiza) en una placa que contiene agar-LB con el antibiótico kanamicina (50 µg/mL), tetraciclina (10 µg/mL), blu-Gal (100 µg/mL) e IPTG (isopropil-β- D-1-tiogalactopiranósido) (40 µg/mL), y se incubó a 37°C por 16 horas. 2.1.2 Se agregó una colonia de E.coli de la cepa DH5-alfa a un tubo de 6 ml con medio LB sin antibiótico y de la misma manera se agregó una colonia azul de E.coli de la cepa DH10BacVSV a un tubo de 6 ml con kanamicina (50 µg/mL) y tetraciclina (10 µg/mL) para luego incubar a 37°C a una agitación de 200 rpm por 16 horas. 2.1.3 Se tomó 1 ml de cultivo bacteriano y se adicionó a 50 ml de medio LB sin antibiótico para la cepa DH5-alfa y con antibióticos para la cepa DH10BacVSV (ver 2.1.2). Se incubó a 37°C a una agitación de 200 rpm hasta que su densidad óptica (DO) a 600 nm sea de 0.3- 0.4 (0.35 óptimo). 32 2.1.4 Se pasó el contenido a tubos de 50 ml enfriados previamente (-80°C) e incubó en hielo durante 10 minutos. 2.1.5 Se centrifugó a 4583 rpm a 4°C por 10 minutos. Se decantó el sobrenadante y secó bien el pellet. Se dejó los tubos en posición invertida sobre un papel toalla para eliminar todas las trazas de medio. 2.1.6 Se resuspendió el pellet en 20 ml de 0.1 M de CaCl2 y homogenizó suavemente. Se incubó durante 15 minutos en hielo. 2.1.7 Se centrifugó a 4583 rpm a 4°C por 10 minutos y se descarto el sobrenadante. 2.1.8 Se resuspendió el pellet con 1 ml de la mezcla 0.1 M de CaCl2 al 15% de glicerol y se homogenizaron suavemente. 2.1.9 Se dispensó en fracciones de 100 µl en tubos de 1.5 ml estériles colocados en una caja conteniendo isopropanol previamente enfriado a -20°C. Se guardó a -80°C. 2.2 Transformación de células bacterianas químicamente competentes de la cepa DH5-alfa con el plásmido “Ch-gpJ” (90) 2.2.1 Se agregó 200 ng del plásmido “Ch-gpJ” a 100 µl de suspensión de células competentes. Esta mezcla se incubó en hielo por 30 minutos seguido de choque térmico de 45 segundos a 42°C en baño maría y 2 minutos en hielo. 33 2.2.2 Se añadió 800 µL de medio SOC (Life Technologies, EE.UU.) y se incubó por 1 hora a 37°C con agitación de 150 rpm. 2.2.3 Se sembró 70 µl de suspensión bacteriana en una placa LB-agar con gentamicina (7 µg/ml) y se incubó a 37°C por 24 horas. 2.3 Purificación del plásmido “Ch-gpJ” 2.3.1 La purificación del plásmido “Ch-gpJ” se realizó a partir de 5mL de cultivo de la cepa DH5-alfa utilizando el Kit QIAprep Spin Miniprep (QIAgen, Alemania) siguiendo las instrucciones del fabricante. La correcta transformación se corroboró mediante secuenciación del plásmido “Ch-gpJ” así como por digestión enzimática utilizando XbaI y SmaI (New England Biolabs, EE.UU.) siguiendo las instrucciones del fabricante. 2.4 Transformación/Transposición de células bacterianas químicamente competentes de la cepa DH10BacVSV con el plásmido “Ch-gpJ”.(Fig. 4A y 4B) (90) 2.4.1 La transposición del plásmido “Ch-gpJ” en el bácmido (el cual contiene el genoma de baculovirus y el gen de resistencia de kanamicina) presente en la cepa DH10BacVSV de E. coli se realizó usando los sitios de reconocimientos denominados Tn7R y Tn7L. La transposición se realizó en presencia de un plásmido ayudador presente en la cepa DH10BacVSV que contiene la secuencia del gen 34 de resistencia de tetraciclina y la secuencia codificadora de la transposasa que facilitará la transposición (91) (Barry G., 1988). 2.4.2 Se agregó 200 ng del plásmido “Ch-gpJ” a 100 µl de suspensión de células competentes y se incubó en hielo por 30 minutos seguido de choque térmico de 45 segundos a 42°C en baño maría y 2 minutos en hielo. 2.4.3 Se añadió 800 µL de medio SOC (Life Technologies, EE.UU.) y se incubó por 4 horas a 37°C con agitación de 200 rpm. 2.4.4 Posteriormente 70 µL células transformadas fueron sembradas en placas LB-agar que contienen kanamicina (50 µg/mL), tetraciclina (10 µg/mL), gentamicina (7 µg/mL), IPTG (40 µg/mL) y blue-Gal (100 µg/mL) y se incubó a 37°C por 48 horas. 2.4.5 Se tomó una colonia blanca y se sembró en 6 mL de medio LB que contiene gentamicina, kanamicina y tetraciclina (ver 2.4.4) a 37°C y 200 rpm, posteriormente 1mL del cultivo se hará crecer en 50 ml de medio LB con gentamicina, kanamicina y tetraciclina a 37°C y 200 rpm. 2.4.6 La purificación del “bácmido-Ch-gpJ” se realizó usando el kit Plasmid Purification Midiprep (QIAGEN, Alemania) siguiendo las instrucciones del fabricante. Para confirmar la transposición se diseñaron cebadores que amplificaron una región de gpJ, luego la secuencia amplificada fue secuenciada. 35 2.5 Transfección de células de insecto (Sf9) con el “bácmido - Ch-gpJ” recombinante (Fig. 4-C) (92) 2.5.1 La transfección de “bácmido-Ch-gpJ” en células de insecto Sf9 se realizó utilizando el lípido catiónico Cellfectin II (Life Technologies, EE.UU). Para lo cual se usó una placa de 6 pozos con 8 x 105 células Sf9/pozo en 2 ml de medio de cultivo de insecto sin suero fetal bovino (SFB) y sin antibióticos. 2.5.2 Se mezcló 8 µL de Cellfectin II con 100 µL de medio no suplementado y sin antibióticos en un microtubo de 1.5 mL y se incubó por 30 minutos a temperatura ambiente. 2.5.3 En otro microtubo de 1.5 mL se agregó 1 µL (1ug total) de “bácmido-Ch-gpJ” purificado (1µg total) con 100 µL de medio no suplementado y sin antibióticos. Se combinó ambos contenidos y se incubó por 30 min a temperatura ambiente. 2.5.4 Luego se añadió los 210 µL de la mezcla obtenida a cada pozo que contiene las células sembradas y se incubó por 3 a 5 horas a 27°C. 2.5.5 Se removió la mezcla de la transfección y se colocó 2 mL de medio suplementado sin antibióticos. Luego se incubó las células a 27°C por 120 horas. 2.5.6 El quinto día se cosecharon las células transfectadas de cada pozo y se centrifugó a 3000 rpm por 5 minutos a temperatura ambiente. Se descartó el pellet y se guardó el sobrenadante a 4°C protegido de la luz. Este sobrenadante esto fue considerado como “P0” de 36 baculovirus o stock inicial de baculovirus recombinante “Ch-Bv- gpJ”. 2.6 Amplificación viral del baculovirus “Ch-Bv-gpJ” recombinante (Fig. 4-D). (93) 2.6.1 La amplificación viral de baculovirus recombinante “Ch-Bv-gpJ” se realizó en cultivos de células de insecto Sf9 en flasks de 25 cm2 (4 x 106 células totales), 75 cm2 (1.2 x 107 células totales), 225 cm2 (3.6 x107 células totales) y en spinner de 100 mL a una densidad celular de 1.5 x 106 células/mL (células en suspensión) con el fin de incrementar el stock viral de “Ch-Bv-gpJ”. Todos los sobrenadantes obtenidos de cultivo celular fueron guardados con 2% de SFB a 4°C. 2.6.2 Para cada pasaje de cultivo celular se realizó la detección de fluorescencia del gen reportero mCherry presente en la secuencia genómica del propio bácmido usando el microscopio ZEISS Observer A1 AXIO con sistema Colibri.2 mediante filtros estándares y a una amplificación de 200X. 2.7 Titulación viral por ensayo de placa (Fig. 4-D). 2.7.1 El producto obtenido de la amplificación viral de “Ch-Bv-gpJ” fue utilizado para la titulación viral por ensayos de placa, para lo cual se usó dos placas de 6 pozos que contienen 1 x 106 células de insecto/pozo en 2mL de medio de cultivo de insecto sin SFB. Las 37 células se incubaron por 1 hora a 27°C para permitir que se adhieran al fondo de cada placa. 2.7.2 Se removió el medio y se colocó 1 mL/pozo de cada dilución seriadas de virus (por duplicado) y se incubó por 1 hora a temperatura ambiente. Preparación de diluciones seriadas de factor 1/10 (virus): Para ello se diluyó 0.5mL de virus obtenido de la amplificación viral en 4.5 mL de Grace´s insect medium 1x (Invitrogen, EE.UU) sin SFB haciendo 8 diluciones consecutivas seriadas de la misma manera hasta lograr la dilución deseada. Se trabajará con diluciones comprendidas entre 10-4 a 10-8. 2.7.3 Se removió las diluciones de virus de cada pozo y se colocó 2 mL de agarosa al 1% (Invitrogen, EE.UU). Preparación de agarosa al 1% (para 2 placas de 6 pozos): a) Se agregó 5mL de SFB inactivado (inactivación a 56°C por 30 minutos) a un frasco de 50mL que contiene 25 mL de Grace´s insect medium 2x (Life Technologies, EE.UU). b) De a) mezcla se tomó 12.5mL y se mezcló con 6.25 mL de agua ultra-purificada y colocó en un frasco estéril de 50mL a 37-40°C en baño maría. c) 0.25g de agarosa se disolvió en 6.25mL de Grace´s insect medium 1x sin SFB y se calentó a 70°C por 10-20 minutos 38 (baño maría) y se mezcló junto a la solución del rubro b) a 37-40°C. 2.7.4 Se permitió solidificar la agarosa por 1 hora a temperatura ambiente. La placa se incubó a 27°C en un ambiente húmedo por 7-10 días. 2.7.5 Al décimo día se agregó a cada pozo de la placa 2mL de ácido tricloroacético al 20% y se dejó incubar por 30 minutos. 2.7.6 Se retiró el ácido tricloroacético de cada pozo de la placa y luego se procedió a remover la agarosa con ayuda de un bisturí. 2.7.7 Se agregó 800µL de cristal violeta (0.1% de cristal violeta en 20% de metanol) a cada pozo por 5 minutos. Luego se lavó cada pozo utilizando agua destilada y se dejó secar para luego contar las unidades formadoras de placa (UFP). �í���� � ��� �� � = �ú���� �� ��� ∗ ������ �� ������ó� ������� (��) �� ��ó���� ��� ���� 39 Figura 4. Esquema de trabajo con el sistema de expresión de proteínas en célula de insecto (baculovirus) (94) 2.8 Concentración de baculovirus recombinante “Ch-Bv-gpJ” 2.8.1 Se realizó la concentración de baculovirus recombinante “Ch-Bv- gpJ” a partir de sobrenadante de cultivo mediante ultracentrifugación en una ultracentrífuga OptimaTM L-100K Ultracentrifuge (Beckman Coulter, EE.UU) utilizando solución de sacarosa al 27% a 24 000 rpm por 1 hora y 30 minutos a 4°C al vacío empleando el rotor SW28. 40 2.9 Expresión de baculovirus recombinante “Ch-Bv-gpJ” en células de insecto (Sf9) 2.9.1 Detección de la cola de histidina (6x-histidina) mediante ensayos de inmunodetección (Western Blot) 2.9.1.1 Para realizar la expresión de baculovirus recombinante “Ch- Bv-gpJ” se sembró 3 matraces con 50 mL de cultivo de célula de insecto Sf9 a una densidad celular de 0.88 x 106 células/mL, las cuales se incubaron durante 24 horas a 27°C. 2.9.1.2 A las 24 horas después de la siembra, las células de insecto fueron infectadas con baculovirus recombinante “Ch-Bv- gpJ” a MOI (multiplicidad de la infección) de 0.01; 0.05 y 0.1. Durante los días después de la infección, se colectó 1mL de cultivo celular en un microtubo de 1.5 mL y se centrifugó a 3000 rpm por 10 minutos a temperatura ambiente. Tanto el sobrenadante como el pellet celular fueron usados para evaluaciones posteriores. 2.9.1.3 Al pellet celular se le agregó buffer de lisis (50 mM de Tris- HCl, 150 mM de NaCl, 10% de DMSO, 4 mM de EDTA, 0.6% de CHAPS e inhibidor de proteasas 1:1000) a una proporción de 1mL de buffer de lisis por cada 20 x 106 células e incubadas a 4°C en agitación durante 16 horas. 41 2.9.1.4 Las células fueron centrifugadas a máxima velocidad por 5 minutos. El pellet obtenido de la centrifugación fue llamado resto celular y el sobrenadante fue llamado lisado celular. 2.9.1.5 Se agregó 5x buffer de cargado (90 mM de DTT y 3.64 M de úrea) tanto al lisado celular como a el resto celular y al sobrenadante del pellet celular de tal manera que se colocó 20 µg de muestra por pozo. Estas muestras fueron calentadas a 95°C durante 5 minutos para luego ser incubadas en hielo durante 2 minutos. 2.9.1.6 Se realizó la separación electroforética mediante SDS- PAGE (stacking gel al 5% a pH 6.8 y gel de resolución al 10% a pH 8.8) a 0.01 amperios por 1 hora y 30 minutos, seguido de una transferencia semi-seca de las proteínas a una membrana de nitrocelulosa utilizando el sistema de transferencia eblotTM (Genscript, EE.UU), según las instrucciones del fabricante. 2.9.1.7 La membrana de nitrocelulosa que contiene a las proteínas transferidas fue utilizada para el ensayo de western blot. La membrana fue incubada en buffer de bloqueo preparado al 5% de albúmina de suero de bovino (BSA) (Sigma, EE.UU) en buffer PBS durante 1 hora en agitación a temperatura ambiente. 42 2.9.1.8 Se removió el buffer de bloqueo y se agregó 10 mL del anti- histidina (anticuerpo de ratón conjugado a HRP que reconoce 6x-histidina; Genscript, EE.UU) preparado al 2.5% de BSA en buffer PBS a una concentración de 100 ng/mL durante 1 hora en agitación a temperatura ambiente. 2.9.1.9 Se removió el anticuerpo y se realizó 3 lavados de 15 minutos con 10 mL de buffer TTBS filtrado (1x buffer: 100 mM Tris-base, 150 mM de cloruro de sodio, 0.01% de Tween 20) y posteriormente se reveló utilizando tabletas de DAB (3,3´- Diaminobenzidina) (Sigma, EE.UU). La reacción de revelado se detuvo agregando agua ultra- purificada. 2.9.2 Detección de gp64 mediante ensayos de inmunodetección (Western Blot) 2.9.2.1 Para llevar a cabo la expresión de baculovirus recombinante “Ch-Bv-gpJ” se sembró 8 matraces con 50 mL de cultivo de célula de insecto a una concentración de 0.88 x 106 células/mL, las cuales se incubaron durante 24 horas a 27°C. 2.9.2.2 Al día siguiente las células de insecto fueron infectadas con baculovirus recombinante “Ch-Bv-gpJ” y baculovirus no recombinante a MOI de 0.1. Cada día se cosechó 2 matraces (uno infectado con baculovirus recombinante y otro infectado con baculovirus no recombinante), a los cuales se 43 centrifugó a 3000 rpm por 10 minutos separando en diferentes tubos de 50 mL el sobrenadante del pellet celular. 2.9.2.3 Al pellet celular se le agregó buffer de lisis (50 mM de Tris- HCl, 150 mM de NaCl, 10% de DMSO, 4 mM de EDTA, 0.6% de CHAPS e inhibidor de proteasas 1:1000) a una proporción de 1mL de buffer de lisis por cada 20 x 106 células e incubadas en agitación a 4°C durante 16 horas. 2.9.2.4 Al día siguiente las células fueron centrifugadas a máxima velocidad por 5 minutos. El pellet obtenido de la centrifugación fue llamado resto celular y el sobrenadante fue llamado lisado celular. 2.9.2.5 Se agregó 5x de buffer de cargado (90 mM de DTT y 3.64 M de úrea) tanto al lisado celular como a el resto celular y al sobrenadante del pellet celular de tal manera que se colocó 20 µg de muestra por pozo. Estas muestras fueron sometidas a 95°C durante 5 minutos para luego ser incubadas en hielo durante 2 minutos. 2.9.2.6 Se realizó la separación electroforética mediante SDS- PAGE (stacking gel al 5% a pH 6.8 y gel de resolución al 8% a pH 8.8) a 0.01 amperios por 1 hora y 30 minutos seguido de una transferencia semi-seca de las proteínas a una membrana de nitrocelulosa utilizando el sistema de 44 transferencia eblotTM (Genscript, EE.UU), según las instrucciones del fabricante. 2.9.2.7 La membrana de nitrocelulosa que contiene a las proteínas transferidas fue utilizada para el ensayo de western blot. La membrana fue incubada en buffer de bloqueo preparado al 5% de albúmina de suero de bovino (BSA) (Sigma, EE.UU) en buffer PBS durante 1 hora en agitación a temperatura ambiente. 2.9.2.8 Se removió el buffer de bloqueo y se agregó 10mL de anticuerpo de ratón que reconoce gp64 de baculovirus (Abcam, EE.UU) preparado al 2.5% de BSA en buffer PBS a una dilución de 1/5000 a una concentración de 100ng/mL y se incubó por 2 horas en agitación a temperatura ambiente. 2.9.2.9 Se removió el anticuerpo y se realizó 3 lavados de 15 minutos con 10 mL de buffer TTBS filtrado (1x buffer: 100 mM Tris-base, 150 mM de cloruro de sodio, 0.01% de Tween 20). Posteriormente se agregó 10mL del conjugado (anticuerpo de cabra conjugado a HRP que reconoce IgG de ratón; Genscript, EE.UU) a una concentración final de 100ng/mL y se dejó incubar por 1 hora en agitación a temperatura ambiente. 2.9.2.10 Se realizó 3 lavados de 15 minutos con 10 mL de buffer TTBS filtrado por cada lavado y se reveló utilizando tabletas 45 de DAB (3,3´- Diaminobenzidina) (Sigma, EE.UU). La reacción de revelado se detuvo agregando agua ultra- purificada. 2.9.3 Ensayo de inmunofluorescencia directa para detección de gpJ en células de insecto 2.9.3.1 Se sembró 5.5 x 105 células de insecto/pozo en una placa de 24 pozos. Estas células se infectaron con baculovirus recombinante “Ch-Bv-gpJ” a MOI de 1 y el control negativo no fue infectado con a baculovirus. Luego las placas fueron incubadas a a 27°C. 2.9.3.2 A las 48 horas después de la infección, tanto las células infectadas como el control negativo fueron fijadas, permeabilizadas y bloqueadas usando el kit Image-iT Fixation/Permeabilization kit (Life Technologies, EE.UU) siguiendo las instrucciones del fabricante. 2.9.3.3 Después del bloqueo, se agregó 0.35mL de conjugado (anticuerpo de ratón conjugado a FITC que reconoce 6x- histidina; Genscript, EE.UU) preparado en PBS a una concentración de 1.43 µg/mL por cada pozo 2.9.3.4 La detección del anticuerpo conjugado a FITC y de la expresión de los genes reporteros mCherry y DsRed se realizaron por microscopía de fluorescencia mediante el 46 microscopio ZEISS Observer A1 AXIO con sistema Colibri.2 utilizando filtros estándares. 3. Componente: Ensayos serológicos e inmunológicos 3.1 Ensayo de Sero-neutralización del baculovirus recombinante “Ch-Bv- gpJ” 3.1.1 Se sembró 1x 105 células de insecto/pozo en un volumen final de 100µL en dos placas de 96 pozos. Se permitió por 1 hora que las células se adhieran al fondo de la placa a una temperatura de 27°C. 3.1.2 Tanto los sueros de aves infectadas con el virus de laringotraqueitis infecciosa aviar (adquiridos de Charles River Laboratories International Inc., EE.UU) como sueros provenientes de aves libres de patógeno (SPF) fueron diluidos sucesivamente en serie a un factor de 1/2 (diluciones de 1/2 hasta 1/4096) en medio de cultivo de células de insecto. La dilución 1/4096 fue considerada como el control de infección. 3.1.3 A estas diluciones se agregó baculovirus recombinante “Ch-Bv- gpJ” y baculovirus no recombinante a MOI 0.1 y posteriormente estas mezclas fueron incubadas a 37°C por 1 hora. 3.1.4 Luego se agregó 100 µL de cada mezcla a cada pozo por duplicado y se incubó a 27°C por 3 a 6 días. Al control negativo no se le agregó la mezcla. 47 3.1.5 La fluorescencia mCherry fue detectada mediante el equipo Twinkle LB 970 (Berthold Technologies, Alemania) usando filtros estándares. Los parámetros de medición usados fueron: 5000 de intensidad de luz y 0.25 segundos para la captación de fluorescencia. 3.1.6 Las intensidades de fluorescencia obtenidas de las muestras que fueron igual o menor al control negativo fueron descartadas, luego las intensidades de fluorescencia (IF) de cada muestra fueron divididas entre el control de infección. 3.1.7 Posteriormente se procedió con la normalización de datos usando las siguientes fórmulas: Donde: A: Intensidad de fluorescencia relativa (IFR) (suero de aves infectadas con ILTV) 1: Intensidad de fluorescencia proveniente de células de insecto expuestas a suero de aves ILTV con baculovirus recombinante “Ch-Bv-gpJ” dividida entre el control de infección. 2: Intensidad de fluorescencia proveniente de células de insecto expuestas a suero de aves ILTV con baculovirus no recombinante dividida entre el control de infección. Donde: B: Intensidad de fluorescencia relativa (IFR) (suero de aves SPF) 3: Intensidad de fluorescencia proveniente de células de insecto expuestas a suero de aves SPF con baculovirus recombinante “Ch-Bv-gpJ” dividida entre el control de infección. A = IF1 /IF2 B = IF3/IF4 48 4: Intensidad de fluorescencia proveniente de células de insecto expuestas a suero de aves SPF con baculovirus no recombinante dividida entre el control de infección. 3.2 Evaluación in vitro de baculovirus recombinante “Ch-Bv-gpJ” 3.2.1 Activación de células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) (95) 3.2.1.1 La toma de muestra de sangre se realizó de la vena braquial del ala de aves SPF de 36 a 42 semanas de edad, para lo cual se utilizó tubos con heparina de sodio (75USP) (BD Vacutainer, EE.UU). 3.2.1.2 El aislamiento de PBMCs se realizó a partir de 4mL de sangre mediante gradiente de densidad. La sangre fue diluída 1/2 en buffer D-PBS. 3.2.1.3 Posteriormente la mezcla fue colocada sobre histopaque 1077 (Sigma, EE.UU) a un volumen igual al de D-PBS utilizado en la mezcla y centrifugada a 400 g por 30 minutos a temperatura ambiente. 3.2.1.4 La interfase formada entre el histopaque y la sangre fue tomada para luego ser lavada dos veces en 20 mL de D-PBS y centrifugada a 300 g por 10 minutos a temperatura ambiente. 3.2.1.5 El pellet fue resuspendido en 1mL de medio de cultivo RPMI 1640 (Sigma, EE.UU) suplementado. Al medio de 49 cultivo se agregó 10% de SFB, 2mM de Glutamax-I, 50µM β-mercaptoetanol y 1% antibiótico-antimicótico. 3.2.1.6 El conteo de células viables se realizó con tripan blue al 0.4%. Para ello se realizó una dilución 1/40 de las células en buffer D-PBS y dicha mezcla fue diluida 1/2 con tripan blue. 3.2.1.7 Se sembró 106 células por pozo en un volumen total de 50 µL en una placa de 96. 3.2.1.8 Se agregó baculovirus recombinante “Ch-Bv-gpJ” y no recombinante a MOI 0.05; 0.1 y 0.2 por triplicado. CpG ODN: GTC GTT GTC GTT GTC GTT (96) se usó como control positivo para la inducción de chIL-12 a una concentración de 40 µM por triplicado. El control negativo no fue expuesto a ningún agente estimulador. Se incubó por 2 horas a temperatura ambiente en una suave agitación. 3.2.1.9 Luego se incubó a 41°C en 5% de CO2, los sobrenadantes de cada pozo fueron recolectados a intervalos de 24; 48 y 72 horas. Previo a la recolección de sobrenadantes las placas fueron centrifugadas a 1000 rpm por 15 minutos y luego guardados a -20°C hasta su uso. 3.2.2 Cuantificación de chIL-12 en sobrenadantes de cultivo de PBMCs mediante ELISA sándwich (Chicken IL12 p40 Do-It- Yourself ELISA, Kingfisher Biotech, Inc.) 50 3.2.2.1 La adsorción del anticuerpo de captura a la placa se realizó a una concentración de 2 µg/mL para chIL-12 preparado en buffer carbonatado (4.3g NaHCO3 y 5.3g Na2CO3 para 1L pH 9.4) de los cuales 100 µL fueron colocados en cada pozo de la placa de ELISA MaxiSorp (Thermo Fisher Scientific, EE.UU). Se incubó a 4°C por 16 horas. 3.2.2.2 Se lavó 3 veces con 100 µL de buffer de lavado (PBS pH 7.4 al 0.05% Tween 20) y luego se agregó 100 µL de buffer de bloqueo (PBS pH 7.4 al 0.5% BSA al 0.1% Tween 20) y se incubó a temperatura ambiente por 1 hora y luego se eliminó los sobrenadantes de cada pozo. 3.2.2.3 La preparación de las proteínas estándares se realizó de acuerdo a las instrucciones del fabricante en un rango de 10000 pg/mL a 15.63 pg/mL para chIL-12. Los sobrenadantes producto del ensayo de activación de PBMCs fueron agregados a cada pozo. 3.2.2.4 Inmediatamente se agregó 50 µL del anticuerpo de detección preparado en buffer de bloqueo a una concentración de 0.3 µg/mL para chIL-12 respectivamente. Se incubó por 2 horas en agitación a 675 rpm a temperatura ambiente. 3.2.2.5 Se lavó 5 veces con buffer de lavado y se agregó 100 µL de estreptavidina-HRP en 5 mL de buffer de bloqueo a una concentración de 200ng/mL. 51 3.2.2.6 Se agregó 100 µL de TMB (3,3´,5, 5´-tetrametilbenzidina) (Abcam, EE.UU) y se dejó incubar por 30 minutos en agitación a 675 rpm a temperatura ambiente, protegido de la luz. 3.2.2.7 Finalmente se agregó 100 µL de H2SO4 a 2N para luego ser leídos a 450nm en el lector de ELISA BioTekTM EonTM (Fisher Scientific, EE.UU). 4. Componente: Inmunización y desafío 4.1 Ensayo experimental de TCID50 para determinar la dosis infectiva media en cultivo celular para una cepa de campo de ILTV. El ensayo de TCID50 (dosis infectiva media de cultivo celular) nos permitió calcular la dosis necesaria del virus de laringotraqueitis infecciosa aviar de campo para el desafío. Para esto se sembró 1.2 x 104 células de hepatoma de pollo (LMH) por pozo en una placa de 96 pozos. El ensayo y el análisis se realizó según Reed and Muench (97). 4.2 Ensayo de inmunización y desafío en aves Las características de las aves y las condiciones en que se realizó el ensayo se detallan en la Tabla 1. Tabla 1. Grupos de aves para ensayo de inmunización y desafío 52 GRUPOS Número de aves SPF* Edad (días) Inmunización Dosis (UFP/ave) Desafío (TCID50 ILTV) A 10 1 Baculovirus recombinante “Ch-Bv-gpJ” 105 1.7 x 103 B 10 1 Baculovirus recombinante “Ch-Bv-gpJ” 106 1.7 x 103 C 10 1 Baculovirus recombinante “Ch-Bv-gpJ” 107 1.7 x 103 D 10 1 Baculovirus no recombinante 106 1.7 x 103 E 10 1 - - - F 10 1 - - 1.7 x 103 *Aves SPF son pollos blancos leghorn (white leghorn chickens) que han sido evaluados serológicamente contra más de 30 patógenos en Charles River Laboratories International Inc. (EE.UU) y cuyos huevos son enviados a nuestros laboratorios y mantenidos bajos los mismos estándares en la Planta de Incubación de Huevos SPF, en FARVET SAC. La Tabla 2. presenta la descripción detallada del esquema de inmunización y los eventos de la toma de muestra. Tabla 2. Descripción de eventos para ensayo de inmunización y desafío Edad de pollos Descripción de eventos 1 día Toma de sangre (sueros pre-inmunes). Inmunización intranasal 7 días Toma de sangre para ensayo de ELISA y citometría de flujo 14 días Toma de sangre para ensayo de ELISA y citometría de flujo. Desafío vía nasal y ocular 21 días Toma de sangre para ensayo de ELISA y citometría de flujo. Hisopado traqueal. Signos clínicos 53 28 días Toma de sangre para ensayo de ELISA y citometría de flujo. Hisopado traqueal. Signos clínicos 4.3 Evaluaciones de signos clínicos, moleculares, serológicas e inmunológicas. 4.3.1 Signos clínicos 4.3.1.1 Los signos clínicos de las aves evaluadas serán categorizados según la clasificación usada por Fuchs W. y colegas (40). Puntajes: (0) animales sanos; (1) ligeramente enfermos: jadeos o estornudos, tos ocasional; (2) enfermo: permanente desorden respiratorio, rinitis, aislamiento y aparente estado depresivo del animal; (3) severamente enfermo: marcada disnea, expectoración de mucosa con sangre, pico abierto y marcado estado de cansancio; (4) muerte. 4.3.1.2 Los puntajes serán tomados diariamente por un periodo de 10 días después del desafío para todas las aves de cada grupo. 4.3.2 Evaluación de la carga viral por reacción en cadena de polimerasa (PCR) cuantitativo (qPCR) 4.3.2.1 Los hisopos estériles usados fueron previamente embebidos en PBS para luego ser usados en la toma de muestra traqueal. 54 4.3.2.2 El ADN viral fue extraído mediante el kit QIAamp MinElute Virus Spin (QIAgen, Alemania) de forma automática en el QIAcube (QIAgen, Alemania). 4.3.2.3 Cada reacción de PCR cuantitativo (qPCR) se realizó en un volumen final de 20 µL a una concentración de 1x de LightCycler®480 SYBR Green I Master (Roche, Alemania), 0.125 µM de cada cebador y 5 pg de ADN. El qPCR se realizó en el termociclador LightCycler®480 (Roche, Suiza) y RotorGene-Q (QIAgen, Alemania). 4.3.2.4 La estandarización, preparación de la curva estándar, selección de cebadores y ciclado del protocolo se realizó usando métodos llevados a cabo en el Laboratorio de Biotecnología Molecular y Genómica en FARVET SAC y el PCR cualitativo se realizó según Zhao (98). 4.3.3 Evaluación serológica por ELISA 4.3.3.1 Se incubó la muestra de sangre a 37°C por 1 hora para permitir la coagulación de células sanguíneas. Luego se dejó a 4°C por 16 horas y posteriormente se centrifugó a 4000 rpm por 20 minutos a 4°C. El suero obtenido fue guardado a -20°C hasta su uso. 4.3.3.2 La detección de anticuerpos presentes en los sueros de las aves se realizó mediante el kit de ELISA ProFLOK (99) para la detección del virus de laringotraqueitis infecciosa aviar 55 (Synbiotics, EE.UU). El ensayo de ELISA se realizó según las instrucciones del fabricante con algunas modificaciones., las cuales se redactan a continuación brevemente. Inicialmente se realizó la preparación de las muestras de suero, control negativo y positivo de suero. Para las diluciones de las muestras de suero se agregó 6µL de suero en 300µL de buffer de dilución (1/50). Los sueros utilizados como controles positivos y negativos fueron proporcionados por el Kit de ELISA, 6µL de sueros controles se agregaron a 300µL de buffer de dilución (1/50), cada tipo de suero control se evaluo en triplicado. De cada una de estas diluciones se agregó 50µL a cada pozo de la placa y se incubó por 30 minutos a 37°C. Se descartó el sobrenadante de la placa y se lavó con 300 µL de buffer de lavado tres veces. Se agregó 100µL de anticuerpo conjugado a HRP que reconoce IgG de pollo (IgY) a cada pozo de la placa, previa preparación del anticuerpo conjugados (proporcionado por el kit de ELISA): se mezcló 100 µL de este anticuerpo en 10ml de buffer de dilución. Se incubó por 30 minutos a temperatura ambiente y luego se lavó tres veces con 300 µL de buffer de lavado. Se agregó 100 µL de la solución de sustrato y se incubó por 15 minutos a temperatura ambiente. Se agregó 100 µL de solución stop y la lectura de placa se 56 realizó a 405nm. El título de anticuerpo se calculo de la siguiente manera según las instrucciones del fabricante: �� = (���. �� �� ������� − ���. ��� ������� ��������) (���. ��� ������� �������� − ���. ��� ������� ��������) ��� �í���� �� ���������� = (1.450 × �����) + 3.726 �í���� �� ���������� = �������. �� ���. �í���� �� ���������� 4.3.4 Evaluación celular por citometría de flujo 4.3.4.1 La toma de muestra de sangre y el aislamiento de PBMCs se realizó según 3.2.1. 4.3.4.2 Se contaron 1 x 106 células y se marcaron con anticuerpos fluorescentes de ratón conjugados a fluoróforos que reconocen CD41, CD4, CD8 (SouthernBiotech, EE.UU) y CD3, CD45 (USBiological, EE.UU) de pollo y posteriormente fueron incubadas por 30 minutos en oscuridad en 0,1 mL de buffer de tinción (PBS al 10% de SFB en 0,002% NaN3). 4.3.4.3 Luego las muestras fueron lavadas y resuspendidas en 1mL de buffer de tinción. 57 4.3.4.4 Al menos 10 000 eventos fueron contados en el citómetro de flujo GalliosTM (Beckman Coulter, EE.UU) y analizados en el programa Kaluza 1.2. (Beckman Coulter). Partiendo de la población CD45+CD41-, se analizaron las poblaciones de células T CD4+ (CD45+CD3+CD4+) y T CD8+ (CD45+CD3+CD8+), las cuales fueron expresadas en porcentajes. 4.4 Datos estadístico 4.4.1 Diseño experimental Se empleó un diseño de bloques completamente al azar, siguiendo siguiente modelo matemático: Donde: i = 6 tratamientos j = 10 repeticiones Yij = ij –ésima observación en el i-esimo bloque en la unidad experimental µ = Media general Ti = Efecto del tratamiento i βj = Efecto del j-esimo bloque εij = Valor aleatorio, error experimental de la unidad experimental i,j Yij = µ + Ti + βj + εij 58 4.4.2 Análisis estadístico Los datos obtenidos se analizaron utilizando el programa estadístico Stata (v10, 2007, EE.UU.). Dichos datos fueron sometidos a pruebas de homogeneidad de varianza y prueba de normalidad.  Análisis de varianza (ANOVA) para de poblaciones (conteo) de linfocitos T (citometría de flujo).  Análisis de varianza (ANOVA) para detección del título de anticuerpos en seropositivos y Fisher Test para el análisis de la proporción de seropositivos (ELISA).  Analisis no paramétrico Kruskal-Wallis y Dunn Test para la comparación del puntaje (signos clínicos). Todos estos datos análisis fueron sometidos a una significancia estadística de 5% (p<0.05) 59 RESULTADOS 1. Componente: Bioinformático Las secuencias fueron ensambladas in sílico utilizando el programa bioinformático de acceso libre SNAPGENE® y luego fueron sintetizadas por fragmentos, el ensamblado inicial se muestra en la figura 5. Para esto el fragmento 1 de la secuencia “Bv-gpJ” fue sintetizada en el plásmido pUC57, dicha secuencia contiene 4 sitios de reconocimiento de digestión enzimática: EcoRI, HindIII, XbaI y SmaI. Inicialmente los sitios de digestión enzimática EcoRI y HindIII fueron utilizados para clonar la secuencia “Bv-gpJ” en el plásmido donador pACEMam1 (Geneva Biotech, Suiza) (Fig. 6) y posteriormente entre los sitios de restricción de XbaI y SmaI se insertó la secuencia correspondiente al gen que codifica la glicoproteína J o gpJ (fragmento 2), previamente sintetizada en pUC57, (Fig. 7) para finalmente obtener la secuencia “Ch-gpJ”. Figura 5. Fragmento 1 de la secuencia “Bv-gpJ” ensamblada in sílico comprende secuencias del péptido señal (SP) de gp64 (color rosado), DsRed2 (color rojo), dominio transmembrana de gp64 (color guinda) y 6x-histidina (color lila) 60 Figura 6. Inserción del fragmento 1 de la secuencia “Bv-gpJ” en el plásmido donador pACEMam1 (Geneva Biotech, Suiza) Figura 7. Obtención de “Ch-gpJ” mediante la inserción del fragmento 2 en el plásmido donador que contiene el fragmento 1 de la secuencia “Bv-gpJ” 61 2. Componente: Sistema de expresión de proteínas en células de insecto (baculovirus) Después de la obtención del plásmido recombinante “Ch-gpJ” en Laboratorios Genscript (EE.UU), “Ch-gpJ” fue digerido utilizando las enzimas XbaI y SmaI (Fig. 8). Como resultado de la digestión se obtuvo una banda mayor a los 2322 pares de bases (pb) y otra banda mayor a 4361 pb. La banda de menor peso molecular corresponde a la secuencia codificante de gpJ la cual se encuentra flanqueada por los sitios de restricción XbaI y SmaI (Fig. 7). Figura 8. Digestión de plásmido recombinante “Ch-gpJ” con enzimas de restricción XbaI y SmaI. 1-8: plásmidos digeridos. 9: plásmido no digerido. 10: marcador de peso molecular LambdaDNA/HindIII La transformación/transposición del plásmido recombinante “Ch-gpJ” al bácmido que contiene el genoma de baculovirus presente en las células competentes DH10BacVSV (Geneva Biotech, Suiza) se realizó mediante choque térmico obteniéndose clonas que formaron colonias de color blanco y azul. Debido a que la secuencia de reconocimiento para la transposición en el bácmido se encuentra presente dentro de la secuencia del péptido de LacZα, esta quedaría destruida al realizarse correctamente la transposición por lo cual 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 62 β-galactosidasa no podría producirse obteniéndose colonias de color blanco. Caso contrario, las colonias de color azul reflejan que no hubo transposición y por lo tanto β-galactosidasa está activa (Fig. 9). Figura 9. Placa LB agar que contiene colonias recombinantes de color blanco “bácmido-Ch-gpJ” Para confirmar la presencia del inserto “Bv-gpJ” en el bácmido se diseñaron cebadores que amplificaron 1050 pb del gen que codifica gpJ. El producto obtenido fue secuenciado en Laboratorios Macrogen Inc. (Korea), los resultados de secuenciación confirman la presencia del gen que codifica gpJ (Fig. 10). Figura 10. Secuenciamiento de 1050 pb perteneciente al gen que codifica gpJ. A: secuenciamiento utilizando el cebador forward. B: utilizando el cebador reverse. A B 63 La expresión de “Ch-gpJ” se realizó mediante la transfección del bácmido recombinante “Ch-Bv-gpJ” en células de insecto Sf9, los resultados de la transfección y amplificación viral como evidencia de la replicación viral fueron visualizados mediante microscopía de fluorescencia a 200X y enfocados a 610nm (Fig. 11). Figura 11. Células de insecto infectadas con baculovirus recombinante “Ch-Bv-gpJ” (4dpi) detectadas mediante microscopia de fuorescencia. A: Células de insecto no infectadas (control negativo). B, C y D: células de insecto infectadas (4dpi). dpi: días pos-infección. El sobrenadante obtenido de la transfección al cual llamamos P0 fue utilizado para generar P3 mediante infecciones consecutivas de células Sf9 para incrementar la cantidad. de baculovirus recombinante “Ch-Bv-gpJ”, el cual A C D B A 64 luego se tituló mediante ensayo de placa. Después de 10 días se realizó el revelado de la placa usando cristal violeta obteniéndose un valor de 3 x 106 UFP/mL. Por ensayo de western blot utilizando anticuerpo anti-histidina se detectó una única banda de aproximadamente 75 kDa en las muestras provenientes de resto celular para MOIs de 0.01; 0.05 y 0.1 tanto pa