Los biofilms consisten en una asociación de microorganismos que crecen en superficies biológicas o artificiales, causando frecuentemente problemas de salud a través de infecciones crónicas y pérdidas económicas debido a la corrosión inducida microbiológicamente. Para estudiar el desarrollo de biofilms in vitro y evaluar el efecto de diferentes estímulos sobre el mismo, son necesarias metodologías no destructivas de cuantificación y seguimiento en tiempo real. En este trabajo, cuantificamos la cantidad de biofilm formado por células adheridas de Pseudomonas aeruginosa en una placa de pozos múltiples utilizando: 1) detección de pioverdina, un sideróforo fluorescente (excitación: 415, emisión: 475 nm) intrínsecamente producido por el género Pseudomonas, y 2) una metodología de análisis de imágenes asistida por software, que cuantifica los píxeles que están por encima de un umbral en un canal de color específico. Ambos procedimientos se compararon con el método estándar de cuantificación de biofilms de tinción con violeta cristal y posterior resuspensión en ácido acético al 30% para la determinación colorimétrica. En la escala de tiempo utilizada, la cuantificación por análisis de imágenes asistida de software muestra una mejor correlación con la formación de biofilms que la cuantificación mediante pioverdina. Las metodologías de cuantificación desarrolladas permiten un seguimiento no destructivo del desarrollo del biofilm, facilitando el estudio del efecto de los estímulos físicos o químicos que pueden actuar tanto en las etapas iniciales de adherencia como a lo largo de la maduración y crecimiento del biofilm.