La detección y cuantificación de Leishmania es importante para el diagnóstico y el entendimiento de posibles relaciones entre la carga parasitaria (CP) y las manifestaciones clínicas. Estudios en cultivo e histopatología sugieren diferencias en la CP de lesiones con leishmaniasis cutánea (LC) y leishmaniasis mucosa (LM), así como también entre la fase aguda y crónica de LC. Una demostración formal requiere una detección y cuantificación altamente sensible de Leishmania en tejido de lesiones humanas. En este estudio se desarrolló una prueba de PCR en tiempo real cuantitativa que tiene como blanco al ADN minicírculo del kinetoplasto (qPCR-ADNk) para detectar y cuantificar Leishmania (Viannia). Se evaluaron 156 biopsias de pacientes con sospecha clínica de LC o LM y el diagnóstico fue confirmado por microscopia, cultivo o la prueba de PCR cualitativa. La sensibilidad de la prueba de qPCR-ADNk para la detección fue del 97,9% y la especificidad fue 87,5%. Se comparó el desempeño cuantitativo de la qPCR-ADNk con el de una prueba previamente validada (qPCR-G6PD). Los valores de CP cuantificadas por la qPCR-ADNk y la qPCRG6PD tuvieron alta correlación (r = 0,87, P <0,0001), pero la prueba de qPCR-ADNk tuvo mayor sensibilidad. Cuando se analizaron la CP y los parámetros clínicos, las lesiones de LC tenían diez veces la CP de lesiones de LM (p = 0,009). En LC, la CP estuvo inversamente asociada con el tiempo de enfermedad (P = 0,001), pero no hubo diferencias en la CP según: la especie de parásito, la edad del paciente y el número o área de las lesiones. Los resultados indican que la prueba de qPCR-ADNk es útil para detectar y cuantificar Leishmania (V.) en leishmaniasis tegumentaria. Además, se demuestra que una CP alta está asociada con LC y la fase aguda de la enfermedad.