Introducción: Mutaciones en el gen pncA son la mayor causa de resistencia a pirazinamida (PZA), pero existen mecanismos alternativos que también aportan resistencia. El objetivo del estudio fue estandarizar la técnica de complementación del gen pncA en Mycobacterium tuberculosis H37Rv pncA-knockout para evaluar el efecto de las mutaciones en el gen pncA, controlando la variabilidad genética de los aislados clínicos. Metodología: Se generaron cepas complementadas con genes pncA wild type y mutantes D49N, H51R, G78C y F94L a través del sistema de expresión pNIT-1 para evaluar la producción de POA mediante la prueba de Wayne cuantitativa, nivel de expresión del gen pncA y susceptibilidad a PZA usando concentraciones graduales de PZA en condiciones no inducida e inducida. Resultados: El sistema de expresión pNIT-pncA restauró el fenotipo susceptible de la cepa pncA-knockout. Los niveles de expresión basal de los genes pncA resultaron constantes y similares al de la cepa H37Rv. La cepa pncA wild type complementada mostró producción de POA y Concentración Mínima Inhibitoria de PZA similar al de la cepa H37Rv (0.6 uM y 100 ug/mL, respectivamente). A pesar de que la sobreexpresión de pncA wild type en la cepa complementada indujo mayor producción de POA (3 uM), esto no interfirió con la susceptibilidad a PZA. Sin embargo, las cepas pncA mutantes complementadas fueron resistentes en ambas condiciones y la sobreexpresión de los genes pncA mutantes, nueve veces mayor al de la cepa H37Rv (P<0.005), permitió verificar la funcionalidad enzimática de las PZAsas mutantes. Conclusiones: La complementación de la cepa pncA-knockout con el gen pncA wild type, mediante el sistema de expresión pNIT, permitió la restauración del fenotipo susceptible. La sobreexpresión de pncA con mutaciones D49N, H51R, G78C y F94L en las cepas complementadas no cambió el fenotipo resistente en la cepa pncA-knockout, atribuida por las pirazinamidasas mutantes.