La heterorresistencia (HR), es definida como la coexistencia de subpoblaciones bacterianas susceptibles y resistentes a un fármaco, representa un desafío clínico importante en el tratamiento de la tuberculosis (TB), ya que puede pasar desapercibida mediante métodos convencionales de cultivo. La HR puede originarse por coinfección con múltiples cepas de Mycobacterium tuberculosis (una susceptible y otra resistente) o por la aparición espontánea de mutantes resistentes dentro de una población susceptible. Tradicionalmente, el método de proporciones en agar considerado el gold standard para la detección de resistencia permite identificar cepas resistentes incluso cuando representan apenas el 1% de la población bacteriana. Sin embargo, su aplicación rutinaria es limitada debido al tiempo prolongado de incubación (2–3 semanas) y a la infraestructura especializada que requiere. Frente a estas limitaciones, la secuenciación genética, en particular mediante la plataforma portátil Nanopore, surge como una alternativa prometedora, ofreciendo resultados más rápidos y la posibilidad de realizar análisis genómicos y detección de mutaciones asociadas a resistencia. En este contexto, el presente estudio evaluó la capacidad de la secuenciación Nanopore para detectar HR en M. tuberculosis en comparación con el método de proporciones en agar. Para ello, se desarrolló un protocolo que combinó dos métodos de extracción de ADN (fenol-cloroformo purificado con perlas magnéticas y extracción mediante columnas de sílice), dos tipos de bibliotecas (Native Ligation y Rapid Barcoding), y dos tipos de material genético (ADN genómico y amplicones), utilizando muestras de esputo negativas enriquecidas con mezclas decepas susceptibles y resistentes en distintas proporciones. Los resultados indicaron que el método de extracción basado en fenol-cloroformo y purificación con AMPure XP beads produjo una cantidad y tamaño de fragmentos de ADN significativamente mayores que el método basado en columnas. Asimismo, la biblioteca Native Ligation proporcionó una mayor profundidad que la Rapid Barcoding, y el uso de amplicones permitió detectar mutaciones asociadas a subpoblaciones resistentes en comparación al ADN genómico donde no se pudo ni cubrir toda la secuencia de M. tuberculosis. En cuanto a los límites de detección, la secuenciación Nanopore permitió identificar HR cuando la cepa resistente representaba al menos ~10% de la población, mientras que el método de proporciones en agar detectó cepas resistentes desde el 1%. En conclusión, aunque la secuenciación Nanopore no sustituye completamente al método de proporciones debido a su límite de detección más alto, si permite conocer la mutación o mutaciones presentes en el gen asociado a la resistencia de manera rápida y práctica para el diagnóstico de TB HR, con el potencial de optimizar el manejo clínico de los pacientes y fortalecer la vigilancia epidemiológica.Heteroresistance, defined as the coexistence of drug-susceptible and drug-resistant bacterial subpopulations, represents an important clinical challenge in the treatment of tuberculosis because it can go unnoticed by conventional culture-based methods. Heteroresistance may arise from coinfection with multiple Mycobacterium tuberculosis strains, one susceptible and another resistant, or from the spontaneous emergence of resistant mutants within a susceptible population. Traditionally, the agar proportion method, considered the gold standard for resistance detection, can identify resistant strains even when they represent as little as one percent of the bacterial population. However, its routine application is limited by the long incubation time required two to three weeks and by the need for specialized infrastructure. Faced with these limitations, genetic sequencing, in particular using the portable Nanopore platform, emerges as a promising alternative by offering faster results and the possibility of genomic analyses and detection of resistance-associated mutations. In this context, the present study evaluated the ability of Nanopore sequencing to detect heteroresistance in M. tuberculosis compared with the agar proportion method. To that end, we developed a protocol combining two DNA extraction methods phenol-chloroform extraction followed by purification with magnetic beads and silica column extraction two library types Native Ligation and Rapid Barcoding and two types of genetic material genomic DNA and amplicons using M. tuberculosis negative sputum samples spiked with mixtures of susceptible and resistant strains at different proportions. Results indicated that the phenol-chloroform extraction followed by AMPure XP bead purification yielded a significantly greater quantity and fragment size of DNA than the column-based method. Likewise, the Native Ligation library produced greater sequencing depth than the Rapid Barcoding approach, and the use of amplicons allowed detection of mutations associated with resistant subpopulations compared with genomic DNA where full coverage of the M. tuberculosis sequence could not be achieved. Regarding limits of detection, Nanopore sequencing detected heteroresistance when the resistant strain represented at least approximately ten percent of the population, whereas the agar proportion method detected resistant strains from one percent. In conclusion, although Nanopore sequencing does not completely replace the agar proportion method because of its higher limit of detection, it does enable rapid and practical identification of the mutation or mutations present in the resistance-associated gene for diagnosis of heteroresistant TB, with potential to optimize clinical management and strengthen epidemiological surveillance.