La microbiota intestinal influye en la respuesta inmune y en la toxicidad de quimioterapéuticos como el irinotecán, asociada a la actividad de la β-glucuronidasa (βGLU). Los probióticos, como Lactobacillus plantarum, reducen estos efectos adversos mediante la producción de ácidos grasos de cadena corta (AGCC) y la modificación del pH intestinal, lo que podría inhibir la βGLU. Sin embargo, el impacto del pH ácido en su estructura y estabilidad no está completamente dilucidado. Mediante simulaciones en computadora aplicando dinámica molecular (WebGro, AMBER99SB-ILDN) y visualización molecular (Pymol, Molsurfer, PorteinPlus), se evaluó el efecto del pH ácido en las βGLU de E. coli y E. eligens. Los análisis de RMSD, RMSF, Rg y SASA revelaron cambios conformacionales críticos que incluyeron (1) expansión del bolsillo de unión, (2) mayor fluctuación de los residuos en bucles adyacentes al sitio activo, y (3) redistribución de cargas electrostáticas. Estas alteraciones sugieren una menor afinidad por el sustrato a pH ácido. Adicionalmente, la pérdida de enlaces de hidrógeno y el incremento en la energía potencial indicaron un estado estructural inestable en ambas enzimas, compatible con una reducción en su actividad catalítica. Estos resultados no solo proporcionan una comprensión detallada de los mecanismos moleculares mediante los cuales el pH ácido regula la actividad de las βGLU, sino que también abren nuevas vías para futuras investigaciones, como el diseño de inhibidores específicos y el uso de probióticos para modular la actividad enzimática en aplicaciones terapéuticas. En conjunto, este estudio sienta las bases para explorar estrategias que permitan manipular la actividad de estas enzimas en el contexto de enfermedades relacionadas con la microbiota intestinal y la toxicidad asociada a la reactivación de metabolitos.The gut microbiota influences the immune response and the toxicity of chemotherapeutic drugs such as irinotecan, an effect associated with the activity of β-glucuronidase (βGLU). Probiotics, like Lactobacillus plantarum, reduce these adverse effects by producing short-chain fatty acids (SCFAs) and modifying the intestinal pH, which could inhibit βGLU. However, the impact of acidic pH on its structure and stability is not fully elucidated. Using computer simulations applying molecular dynamics (WebGro, AMBER99SB-ILDN force field) and molecular visualization (Pymol, Molsurfer, PorteinPlus), the effect of acidic pH on the βGLU enzymes from E. coli and E. eligens was evaluated. Analyses of RMSD, RMSF, Rg, and SASA revealed critical conformational changes that included (1) expansion of the binding pocket, (2) increased fluctuation of residues in loops adjacent to the active site, and (3) redistribution of electrostatic charges. These alterations suggest a lower substrate affinity at acidic pH. Additionally, the loss of hydrogen bonds and the increase in potential energy indicated an unstable structural state in both enzymes, consistent with a reduction in their catalytic activity. These results not only provide a detailed understanding of the molecular mechanisms by which acidic pH regulates βGLU activity but also open new avenues for future research, such as the design of specific inhibitors and the use of probiotics to modulate enzymatic activity in therapeutic applications. Collectively, this study lays the groundwork for exploring strategies to manipulate the activity of these enzymes in the context of diseases related to the gut microbiota and the toxicity associated with metabolite reactivation.