La secuenciación de lectura larga por Oxford Nanopore Technologies aplicada a Mycobacterium tuberculosis ofrece ventajas para resolver regiones repetitivas y estructuralmente complejas, aunque su desempeño depende críticamente de decisiones pre-analíticas. Este estudio evaluó el impacto de (i) la inactivación térmica — 95 °C/1 h; 80 °C/20 min —, (ii) cuatro métodos de extracción de ADN genómico (ADNg) y (iii) la fragmentación del ADNg a ~10 kpb sobre métricas clave del secuenciamiento (N50, cobertura, profundidad y precisión) y sobre el ensamblaje con lecturas dúplex. Los resultados mostraron que la inactivación a 95 °C/1 h degrada el ADNg y reduce la proporción de lecturas largas. En contraste, la condición sin inactivación térmica combinada con el método de extracción de ADNg M3b con purificación reforzada mejoró el rendimiento del secuenciamiento. Además, la fragmentación controlada del ADN aumentó el rendimiento en gigabases y la profundidad genómica a 214.7 X, con un N50 menor de valor 7.33 kb, manteniendo la cobertura genómica completa. Con el método M3b fragmentado a ~10 kpb, el ensamblaje con lecturas dúplex alcanzó coberturas casi totales del genoma y precisiones comparables a los valores de referencia de ONT, con bajas tasas de errores e indels. En conclusión: (1) debe evitarse la inactivación a 95 °C/1 h si se busca maximizar lecturas largas; (2) los métodos de extracción como M3b con purificación adicional optimizan las razones 260/280 y 260/230 y el rendimiento del secuenciamiento; (3) el método M3b fragmentado a ~10 kpb ± 2 kpb es recomendable cuando se prioriza profundidad y rendimiento total, asumiendo un N50 menor y (4) las lecturas dúplex permiten ensamblajes de alta precisión cuando la cobertura lo permite. Estas decisiones definen un flujo de trabajo que equilibra rendimiento y calidad, adecuado para vigilancia genómica y aplicaciones de investigación.Long-read sequencing by Oxford Nanopore Technologies applied to Mycobacterium tuberculosis offers advantages for resolving repetitive and structurally complex genomic regions, although its performance depends critically on pre-analytical decisions. This study evaluated the impact of (i) heat inactivation — 95 °C/1 h; 80 °C/20 min —, (ii) four genomic DNA (gDNA) extraction methods, and (iii) gDNA fragmentation to ~10 kbp on key sequencing metrics (N50, coverage, depth, and accuracy) and on duplex-read assembly. The results showed that inactivation at 95 °C/1 h degrades gDNA and reduces the proportion of long reads. In contrast, the non-heat-treated condition combined with the M3b gDNA extraction method with reinforced purification improved sequencing performance. In addition, controlled DNA fragmentation increased gigabase output and genomic depth to 214.7×, with an N50 of 7.33 kb while maintaining full genome coverage. With the fragmented M3b method to ~10 kbp, duplex-read assemblies achieved near-complete genome coverage and accuracies comparable to ONT reference values, with low error and indel rates. In conclusion: (1) heat inactivation at 95 °C/1 h should be avoided when maximizing long-read yield; (2) extraction methods such as M3b with additional purification optimize 260/280 and 260/230 ratios and sequencing performance; (3) the M3b method fragmented to ~10 kbp ± 2 kbp is recommended when depth and total output are prioritized, assuming a lower N50; and (4) duplex reads enable high-accuracy assemblies when coverage permits. These decisions define a workflow that balances yield and quality, suitable for genomic surveillance and research applications.