El objetivo del estudio fue evaluar in vitro el efecto en el grosor dentinario del tercio cervical después de la utilización de fresas Gates Glidden N°3, LA AXXESS 20.06 y limas de conformación SX en conductos mesiales de molares mandibulares. Se utilizaron treinta molares mandibulares. Fueron incrustadas en resina acrílica. Los bloques resultantes fueron seccionados horizontalmente a 2 mm por debajo de UCA. Fueron divididos e instrumentados con Gates Glidden N°3, LA AXXESS 20.06 y lima de conformación SX, esto fue realizado por un solo operador capacitado. Fueron fotografiados pre y post instrumentación a través del estereomicroscopio (Leica Microsystems 560). Las imágenes obtenidas fueron analizadas y superpuestas con el software Image Tools 3.01 para determinar el efecto en el grosor dentinario del tercio cervical. Para comparar el efecto se utilizó la prueba de Kruskal-Wallis; y para determinar la significancia estadística se realizó la prueba U de Mann-Whitney. Se encontró diferencias estadísticamente significativas para Gates Glidden N°3 y LA AXXESS 20.06 en relación a la lima de conformación SX a nivel de la superficie mesial. La lima de conformación SX obtuvo el menor efecto sobre el grosor dentinario del tercio cervical. Al comparar el efecto en el grosor dentinario no se encontraron diferencias estadísticamente significativas a nivel de la superficie distal demostrando que el uso de los tres preparadores del tercio cervical es seguro.